Disadvantages

Los parámetros obtenidos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANAVA). Cuando las diferencias fueron significativas (p < 0,05), los valores medios fueron evaluados mediante Diferencias Cuadradas Medias (LSD) usando el test de Tukey (Graph Pad Prism 5.0).

103

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2.A. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE Ad

2.A.1 Ensayos preliminares para la optimización de la oxidación de las LDL

Como se explicó anteriormente, las LDL pueden oxidarse in vivo por diferentes mecanismos mientras que in vitro pueden modificarse oxidativamente en presencia de metales de transición como hierro y cobre. Se ha demostrado que esta LDL oxidada libre de células es indistinguible física, química y biológicamente de las LDL oxidadas por un sistema celular. Uno de los procedimientos más utilizados para medir la resistencia de las LDL a la oxidación in vitro iniciada por cantidades catalíticas de iones de metales de transición, es la determinación del tiempo de latencia (LT) para la formación de dienos conjugados (CD) (Esterbauer y col., 1987; Scheffer y col., 2000). Esterbauer y col., (1989) establecieron un método para la monitorización continua de la oxidación in vitro de las LDL humanas: después de la diálisis contra solución salina tamponada con fosfato para eliminar EDTA (utilizado como anticoagulante) a 4 °C, las LDL (50-100 μg/mL) se oxidan en presencia de 1-10 μmol de cobre a 37 °C, y la formación de dienos conjugados (DC) durante la oxidación de LDL se controla mediante cambios en absorbancia medida espectrofotométricamente a 234 nm. La forma de la curva obtenida se debe a las fases de iniciación y propagación de la oxidación; dependiendo del tiempo se puede ver o no la fase correspondiente a la descomposición (Esquema 3.4.).

Esquema 3.4. Cinética de oxidación de LDL mediante monitoreo continuo del cambio de absorbancia a 234 nm durante 3 h (Esterbauer y col., 1989).

Durante la primera fase (de iniciación) los dienos no aumentan o lo hacen lentamente; los antioxidantes lipófilos presentes en la partícula de LDL protegen a los ácidos grasos poliinsaturados contra la oxidación, la acción protectora de estos antioxidantes disminuye progresivamente, ya que se inactivan y se consumen al eliminar los radicales libres hasta que finalmente el proceso de peroxidación lipídica entra en la fase de propagación. En esta segunda

104

fase los ácidos grasos poliinsaturados se convierten rápidamente en hidroperóxidos de lípidos conjugados, como lo indica el aumento de la absorbancia de 234 nm. Finalmente, la absorbancia disminuye lentamente después de alcanzar su valor máximo (fase de descomposición); lo que se debe a la descomposición de los hidroperóxidos lipídicos a través de una serie de reacciones consecutivas a una variedad de productos. Si bien los cambios de absorbancia entre las distintas fases no son abruptos, la forma de la curva permite diferenciarlas claramente y ajustar cada fase (o toda la curva) según su comportamiento para calcular parámetros cinéticos de la oxidación de las LDL.

Por otro lado, como ha sido previamente mencionado, los iones metálicos catalizan la formación del radical OH· en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2); este radical es uno de los

oxidantes biológicos más potentes (Halliwell, 1999). El ion cúprico (Cu+2) en presencia de un radical anión superóxido se puede reducir a ion cuproso (Cu+1) que es capaz de catalizar la formación de radicales OH• por descomposición del peróxido de hidrógeno a través de la reacción de Fenton:

Cu+2 + O₂•− → Cu+1 + O₂ Cu+1 + H₂O₂ → Cu+2 + OH• + OH−

El radical hidroxilo es extremadamente reactivo y puede reaccionar con prácticamente cualquier molécula biológica como por ejemplo, los ácidos grasos insaturados (Jomova y Valko, 2011). En el presente trabajo, en primer lugar y con el objetivo de optimizar el proceso de oxidación de las LDL, se llevaron a cabo ensayos sobre el sistema control (sin agregado de ninguna molécula antioxidante) expuesto a diferentes condiciones de inducción de la oxidación y monitoreando la formación de DC. La Figura 2.1 muestra la evolución de DC para sistemas control preparados a partir de LDL (concentración final: 1 mg proteína/mL) en presencia de Cu+2 (concentración final = 15 µM), H2O2 0,02 % p/v o ambos, Cu+2/H2O2 respetando las mismas concentraciones de cada

uno utilizadas anteriormente. No se observó formación de DC durante el tiempo de ensayo para el sistema control en ausencia de Cu+2 y de H₂O₂ (C0, contiene únicamente LDL, Figura 2.1), así como en el sistema donde solo se añadió H2O2 a las LDL (C2, Figura 2.1). Cuando solo se añadió

Cu+2 como inductor de la oxidación, se observó un leve aumento de la absorbancia (C1, Figura

2.1). La producción de DC depende de las condiciones de reacción tales como las

concentraciones de LDL y Cu+2, la temperatura y la metodología de aislamiento de LDL (Kleinveld y col., 1992). Incluso cuando se usan condiciones idénticas para oxidar la LDL, los productos pueden diferir significativamente, dependiendo de la composición de ácidos grasos y el estado antioxidante de la preparación de LDL inicial (Levitan y col., 2010). Estos hechos podrían explicar la falta de formación de CD en el tiempo de ensayo en estos controles; es probable que el inicio de la oxidación requiera tiempos más largos en esas condiciones de reacción. Sin embargo, en presencia de Cu+2/H2O2, se registró una curva típica de cinética de formación DC (C3, Figura 2.1). La cinética

105

seguida de una fase de propagación con una pendiente máxima correspondiente a la velocidad de propagación (VP) que se inicia presumiblemente después de que se han consumido los antioxidantes endógenos; finalmente se alcanza una fase de meseta (Jialal y Devaraj, 1996).

Figura 2.1. Evolución de la formación de dienos conjugados (DC) en distintos sistemas control: C0 = LDL + buffer; C1: LDL + Cu+2; C2: LDL + H₂O₂; C3: LDL + Cu+2 + H₂O₂; C4 = LDL + Cu+2 + H₂O₂ + Trolox 0.1 µM.

Por último, utilizando el protocolo correspondiente a C3 se midió el efecto del Trolox, un análogo de vitamina E soluble en medios acuosos. No se observó formación de DC con concentraciones en el intervalo de 1 a 5 µM de Trolox (C4, Figura 2.1.), lo que indica que, en presencia de un antioxidante capaz de neutralizar radicales libres interrumpiendo la cadena de peroxidación lipídica, se previene la oxidación de LDL.

Es probable que en la generación de LDL oxidada in vivo ocurra por la acción consecutiva de varios agentes oxidantes y enzimas. Se ha demostrado que los radicales libres y no radicales (H2O2 entre ellos) oxidantes están presentes en las lesiones ateroscleróticas (Levitan y col., 2010).

En consecuencia, teniendo en cuenta esta información y los resultados previamente mostrados, se seleccionó la combinación Cu+2/H2O2 como inductores de oxidación para analizar el efecto de

las muestras de amaranto en la oxidación de las LDL, utilizándose el control C3 como control de oxidación completa de LDL. Además, se decidió extender el tiempo de ensayo a 240 min para completar la fase de meseta de la curva.

2.A.2 Evaluación de la actividad de Ad

Se analizó la actividad de Ad frente a la oxidación de LDL en comparación con el aislado proteico sin digerir (A) para evaluar el efecto del proceso de digestión gastrointestinal. La presencia de A (0,057 - 0,23 mg de proteína/mL) no produjo modificaciones en la cinética de oxidación con respecto al sistema de control (Figura 2.2.a.). Sin embargo, cuando se agregó Ad a la mezcla de

106

reacción, se registraron fuertes efectos, tales como incrementos considerables en el tiempo de inducción (LT) y una disminución en la velocidad de propagación (VP) (Figura 2.2.b.). Estas respuestas fueron dependientes de la concentración de péptidos/polipéptidos. En el caso de la muestra más diluida (0,057 mg/mL), pudo ajustarse una curva sigmoidal con un buen factor de correlación; el valor LT aumentó en aproximadamente 70 % y el valor VP fue aproximadamente 40 % del valor para el sistema de control. Para muestras más concentradas, las correlaciones del modelo sigmoidal fueron pobres dado que la oxidación fue fuertemente retrasada, como puede verse claramente en la Figura 2.2. LT aumentó en función de la concentración de proteína, logrando incrementos de aproximadamente 150 % con respecto al control (C1).

Figura 2.2. Evolución de la formación de dienos conjugados (DC) (a) Sistemas en presencia de diferentes concentraciones de A. (b) Sistemas en presencia de diferentes concentraciones de Ad. Los valores de TL y VP se muestran en el cuadro. C1 control sin muestra: LDL + Cu+2 + H2O2

A fin de obtener más información sobre los posibles mecanismos de acción de los péptidos de amaranto, se midieron otros parámetros relacionados con la oxidación de lípidos y proteínas en las partículas de LDL. Los ácidos grasos poliinsaturados de los lípidos LDL son los objetivos

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 -0.04 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 C1 0.23 mg/mL 0.11 mg/mL 0.077 mg/mL 0.057 mg/mL MUESTRA (A) VP (Abs/min) LT (min) R 2 C1 0.061 (0.008) 47 0.8412 0.057 mg/mL 0.067 (0.006) 49 0.9495 a) Tiempo (min) A b s( 2 34 n m ) 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 -0.04 0.00 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20 C1 0.24 mg/mL 0.12 mg/mL 0.08 mg/mL 0.06 mg/mL MUESTRA (Ad) VP (Abs/min) LT (min) R 2 C1 0.056 (0.008) 45 0.8026 0.06 mg/mL 0.023 (0.002) 72 0.9224 b) Tiempo (min)  A b s( 2 34 n m )

107

principales de los agentes oxidantes, siendo el derivado hidroperóxido de los fosfolípidos y el reordenamiento de los dobles enlaces para formar dienos conjugados los primeros productos de oxidación. La oxidación posterior da como resultado aldehídos de cadena corta o derivados carboxi, 4-hidroxinonenal (HNE) y malondialdehído (MDA) entre ellos (Levitan y col., 2010). Las sustancias reactivas a TBA (TBARS), como el MDA y otras sustancias, se midieron al final del período de incubación. La inducción de la oxidación con Cu+2/H2O2 (C1) produjo un aumento

significativo (p < 0,05) de TBARS respecto a las LDL en las que no se indujo el proceso oxidativo (C0). Se evaluó el efecto de la presencia de Ad en dos concentraciones (0,12 y 0,24 mg/mL), las cuales no fueron capaces de reducir las TBARS con respecto al sistema control sin antioxidantes (Figura 2.3).

Figura 2.3. Ensayo de TBA luego de 4 h de incubación a 37 ºC en presencia de dos concentraciones de Ad. También se muestran los valores correspondientes a los controles C0 (LDL + buffer) y C1 (LDL + Cu+2 + H2O2). Letras distintas significan diferencias significativas

(p<0,05).

Los aldehídos generados por la oxidación pueden formar aductos con los residuos de lisina de la apo B. Esta modificación de la proteína genera compuestos que fluorescen fuertemente a 430 nm con excitación a 360 nm (Cominacini y col., 1991). La evolución de la fluorescencia en función del tiempo se muestra en la Figura 2.4 para sistemas que contienen Ad en dos concentraciones diferentes. Como puede observarse, cuando el proceso oxidativo no fue inducido (control C0), no se registraron cambios en la fluorescencia a lo largo de toda la incubación. En ausencia de Ad (C1), la fluorescencia presentó, de forma similar a la evolución de DC, un período de inhibición inicial y un segundo período de propagación durante el cual la fluorescencia aumentó rápidamente. Por lo tanto, los datos se ajustaron a la ecuación sigmoidal dosis-respuesta (pendiente variable) (Figura 2.4). Comparando la evolución de DC (Figura 2.2) con la evolución de la fluorescencia para C1 (Figura 2.4), puede observarse que, aunque LT fue menor para la fluorescencia, CD alcanzó el valor máximo antes de 100 min de incubación mientras que la formación de compuestos fluorescentes continuó hasta aproximadamente 200 min. Estas observaciones concuerdan con el hecho de que los DC son productos intermedios de la reacción

108

oxidativa en cadena, mientras que los compuestos fluorescentes pueden representar al menos uno de los productos del paso final, coincidiendo con la modificación de apo-B (Cominacini y col., 1991). En presencia de Ad, la aparición de compuestos fluorescentes se retrasó en función de la concentración peptídica (incremento de LT de aproximadamente 319% para 0,12 mg/mL y 477% para 0,24 mg/mL) (Figura 2.4).

Figura 2.4. Evolución de la fluorescencia durante de 4 h de incubación a 37 ºC en presencia de dos concentraciones de Ad. También se muestran los valores correspondientes a los controles C0 (LDL + buffer) y C1 (LDL + Cu+2 + H2O2).

La modificación proteica da como resultado también la alteración de la movilidad electroforética. Las LDL tienen una superficie cargada negativamente y migran al ánodo durante la electroforesis en gel de agarosa en condiciones no desnaturalizantes. La oxidación hace que la molécula de LDL tenga una carga más negativa, posiblemente debido a la derivatización de residuos de lisina de apo B-100 por algunos aldehídos reactivos o por la acción directa de las especies reactivas del oxígeno que convierte residuos de histidina y prolina en aspartato o glutamato con carga negativa (Jialal y col., 1996). Los oxidantes no radicales como H₂O₂, hipoclorito y peroxinitrito tienden a modificar las proteínas directamente, especialmente la cisteína, la metionina y la tirosina (Levitan y col., 2010). En los presentes sistemas las LDL oxidadas por Cu+2/H₂O₂ (C1) presentaron mayor velocidad de migración que las LDL nativas (C0), siendo la distancia recorrida un 35 % mayor

Figura 2.5). En presencia de Ad (0,12 y 0,24 mg/mL), la movilidad de LDL fue similar a la de LDL

nativa, indicando que estas muestras fueron capaces de prevenir las modificaciones que causaban el cambio de movilidad en las LDL oxidadas.

En un trabajo previo (Orsini Delgado y col., 2015) y también en este trabajo (Capítulo 1) se demostró que el digerido gastrointestinal de las proteínas de amaranto tiene la capacidad de inhibir la formación de radicales OH· por la reacción de Fenton (por péptidos quelantes de metales) así como para neutralizar estos radicales (rompiendo la cadena radicalaria mediante

109

donación de un átomo de hidrógeno). Estos mecanismos de acción podrían ser también relevantes en el retraso que produjo Ad en la oxidación de lípidos y proteínas inducida por Cu+2/H2O2 en las LDL. Teniendo en cuenta los resultados de DC (Figura 2.2), TBARS (Figura

2.3), fluorescencia (Figura 2.5), y electroforesis (Figura 2.5) es posible afirmar que Ad

(concentraciones de 0,12 y 0,24 mg/mL) fue capaz de retrasar el comienzo de la oxidación de los lípidos y de las proteínas pero no pudo inhibir completamente estos procesos. La modificación en la fracción proteica producida por la oxidación de las LDL fue parcialmente inhibida como evidencia la evolución de la fluorescencia. Sin embargo, ese efecto inhibitorio fue suficiente para evitar cambios en la movilidad electroforética de las LDL.

Figura 2.5. Electroforesis en gel de agarosa luego de 4 h de incubación a 37 ºC en presencia de dos concentraciones de Ad. También se muestran los controles C0 y C1. El % de movilidad con respecto a las LDL nativas (C0) se muestra arriba de la imagen del gel.

Campos Espinosa (2019) evaluó la actividad frente a la oxidación de LDL inducida por Cu+2 (24 h) de hidrolizados de proteínas de salvado de avena utilizando pepsina, pepsina + pancreatina, flavourzima, alcalasa y protamex. Se obtuvieron diferentes actividades entre los hidrolizados; los que presentaron mejor capacidad para inhibir la DC fueron correlacionados con mayor presencia de aminoácidos aromáticos; otros hidrolizados que indujeron una menor presencia hidroperóxidos de lípidos se correlacionaron con una alta capacidad de quelación de cobre.

2.B. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS FRACCIONES FPLC SEPARADAS A PARTIR