Use of a Valuation Database as a risk assessment tool compared to the use of reference pricing

Se evaluó el efecto citotóxico de las distintas muestras a través de distintos métodos. 3.3.1. Viabilidad celular por el método del rojo neutro

El ensayo de citotoxicidad por absorción del colorante rojo neutro (RN) se basa en la habilidad de las células viables de incorporar y unir este colorante. El mismo es un colorante catiónico débil que penetra en las membranas por difusión pasiva y se concentra en los lisosomas, uniéndose por enlaces hidrofóbicos y electrostáticos a la matriz lisosomal (Winckler, 1974). Cuando la célula muere, el colorante no puede ser retenido y es liberado al medio extracelular. En consecuencia, la cantidad de colorante retenido es proporcional al número de células viables. Además, la captación de rojo neutro por las células viables se modifica por alteración en la superficie celular o en las membranas lisosomales. La integridad lisosomal, con la concomitante unión del colorante rojo neutro, es un indicador muy sensible de la viabilidad celular (Filman y col., 1975). Se sembraron células Caco-2 TC7 en placas de 96 pocillos en una concentración de 2,5 x 104 células/pocillo y se incubaron en estufa hasta confluencia. Luego se retiró el medio, se lavó 2 veces con PBS estéril y se agregaron 200 µL de la muestra solubilizada en buffer fosfato 35 mM (pH = 7,8). La placa se incubó a 37 °C durante 3 h y luego de retirar la muestra y lavar con PBS se agregó 200 µL de medio que contenía 100 µg/mL de rojo neutro; para la preparación de este medio se usó DMEN Adhesiónsin color, sin SFB, antibióticos ni aminoácidos (EMEVE Medios). Se incubó 3 h a 37 °C,

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se retiró el colorante y se lavó 2 veces con PBS. Finalmente se agregó 100 µL de solución de fijación y extracción (50% etanol y 1% ácido acético) y se agitó 10 min. Se transfirió el sobrenadante a otra placa y se leyó la absorbancia a 540 nm. Se determinó la viabilidad celular según la Ecuación 3.1:

% viabilidad = (Am/AC-) x 100 Ecuación 3.1

Am: absorbancia en presencia de la muestra.

AC-: absorbancia del Control (-) de muerte celular

Control (-) de muerte celular: Buffer fosfato 35 mM, pH = 7,8 Control (+) de muerte celular: Etanol 25 % p/v

3.3.2. Viabilidad celular por determinación de la enzima lactato deshidrogenasa

En el estudio de la citotoxicidad celular, la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) al medio extracelular es un indicativo del daño en la integridad celular por un agente tóxico. De esta manera la determinación de su actividad en el sobrenadante celular es indicativa de la proporción de células muertas. Esta enzima cataliza la conversión de piruvato a lactato, utilizando NADH como cofactor durante la glicolisis y también cataliza las reacciones inversas durante el ciclo de Cori (Decker, 1988; Kaja y col., 2016). La oxidación del NADH por parte de esta enzima implica una caída en la absorbancia a 340 nm.

Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+

Se utilizó la línea celular Caco-2 TC7 sembrada en placas de cultivo de 96 fosas (2,5 x 104 células/pocillo). Luego de 24 h, se retiró el medio de cada pocillo, se agregaron 100 µL muestra y se incubó en estufa por 3 h. Luego se trasvasó el sobrenadante a otra placa y se cuantificó la actividad de LDH mediante el kit comercial LDH-P UV unitest (Wiener Lab, Argentina). Las muestras se hicieron reaccionar con el sustrato reconstituido conteniendo piruvato y NADH siguiendo las especificaciones del fabricante. Se realizó la lectura de la caída de la absorbancia a λ = 340 nm en un lector de placas (SYNERGY HT-SIAFRT, Biotek Instruments, EE. UU) utilizando una placa de 96 pocillos apta para la lectura en el UV (Costar®). La actividad enzimática (UI) se expresó como la variación de absorbancia/min (ΔA/min). Se calculó como el promedio de la diferencia en las absorbancias/ minuto, a los tiempos 0,5, 1,5, 2,5 y 3,5 min. Luego se multiplicó por un factor de corrección dependiente de la temperatura de trabajo según las especificaciones del fabricante. Cada determinación se realizó por triplicado. La citotoxicidad se cuantificó en términos del porcentaje de liberación de LDH (Ecuación 3.3):

% LDH = (LDHmuestra/LDHtotal) x 100 Ecuación 3.2.

LDH (U/I) = ∆A/min x f f (25 ºC, 340 nm) = 4,921

LDHmuestra: LDH (U/I) obtenido por tratamiento con las muestras.

LDHtotal: LDH (U/I) del Control (+) de muerte celular.

Control (+) de muerte: DMEM con Tritón X-100 3% (v/v). Provoca lisis celular. 3.3.3. Viabilidad celular por citometría de flujo

La citometría de flujo (CDF) es una técnica que permite medir las características físicas y químicas de las células u otras partículas biológicas. Los datos obtenidos se pueden usar para comprender y monitorear procesos biológicos y desarrollar nuevos métodos y estrategias para la detección y cuantificación celular. En comparación con otras herramientas analíticas, donde se obtiene un valor único para cada parámetro para toda la población, la CDF proporciona datos para cada partícula detectada. Como las células difieren en sus estados metabólicos o fisiológicos, esta técnica nos permite no solo detectar un tipo de célula particular sino también encontrar diferentes subpoblaciones de acuerdo con sus parámetros estructurales o fisiológicos (Comas-Riu y Rius, 2009). La CDF permite medir simultáneamente múltiples características ópticas (dispersión de luz y fluorescencia) de cada una de las células o partículas presentes en una suspensión. En un citómetro, las células individuales pasan a través de un haz de luz en una corriente de fluido dirigida. A medida que la luz procedente de la fuente de excitación golpea a las partículas en movimiento ocurren fenómenos de dispersión de luz y emisión de fluorescencia que se miden para cada partícula. La diferencia en la magnitud de la señal de dispersión y emisión generada por las células refleja diferencias biológicas entre ellas. Las señales generadas, fluorescentes y no fluorescentes se recolectan y se miden mediante el acoplamiento óptico de la señal a un sistema de detección que consta de filtros, cada uno de los cuales está vinculado a un fotodetector. La información generada con esta técnica puede agruparse en dos tipos fundamentales: 1) la generada por la dispersión de luz: la luz de dispersión hacia adelante en un ángulo pequeño (FSC, Foward Scatter) proporciona información sobre el tamaño de la célula, y la luz dispersada en una ángulo recto (SSC, Side Scatter) proporciona información sobre la granularidad y la morfología celular; 2) la generada por la emisión de luz: ocurre por fluorocromos generalmente añadidos a la célula, cuando son excitados por la fuente luminosa. La fluorescencia producida por estos fluorocromos se detecta mediante tubos fotomultiplicadores.

La citometría de flujo es particularmente importante para investigaciones biológicas, ya que permite el examen cualitativo y cuantitativo de células completas y constituyentes celulares previamente marcados con una amplia gama de reactivos comercialmente disponibles, tales como colorantes y anticuerpos monoclonales, en los instrumentos de clasificación celular activados por fluorescencia (FACS) (Jaroszeski y Radcliff, 1999).

Integridad de la membrana: La viabilidad celular se puede monitorear mediante CDF utilizando la

capacidad de la célula para mantener una barrera efectiva frente al medio externo. Las células con una membrana dañada no pueden sostener ningún gradiente electroquímico y normalmente se clasifican como células muertas. La integridad de la membrana se puede detectar mediante la exclusión o la retención de un marcador. Los más usados son los marcadores de exclusión como el ioduro de propidio o el bromuro de etidio que tiñen los ácidos nucleicos en células con membranas permeabilizadas consideradas muertas (Comas-Riu y Rius, 2009). El ioduro de propidio (IP) es un agente que tiene la propiedad de intercalarse entre los pares de bases del ADN y emitir fluorescencia a una longitud de onda característica (617 nm). Es por esto que este

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colorante es ampliamente utilizado para teñir las células y realizar estudios sobre el ADN de las mismas para conocer cómo se altera la distribución de las fases del ciclo celular. Las células muertas pierden la propiedad de permeabilidad selectiva entre el contenido intracelular y el medio extracelular y por lo tanto, incorporan colorante, el cual se intercala entre las bases del ADN en una relación de una molécula por cada 4-5 pares de bases. Una vez unido a los ácidos nucleicos, la fluorescencia de IP se ve incrementada unas 20-30 veces (Riccardi y Nicoletti, 2006).

Potencial de membrana: Las sondas fluorescentes usadas para determinar el potencial de

membrana son compuestos lipofílicos cargados que pueden atravesar fácilmente las membranas celulares y acumularse en el interior celular. Los fluorocromos como la rodamina 123 y los oxonoles se han usado ampliamente ya sea solo o combinados con marcadores de integridad de membrana como el IP para la determinación del potencial de membrana y en ensayos de viabilidad celular. Dado que la rodamina 123 (Rh123) es una sonda fluorescente catiónica, el potencial eléctrico negativo que existe a través de la membrana mitocondrial permite el transporte de la sonda hacia su interior (Johnson y col.,1980) y por lo tanto esta sonda es indicativa de una correcta función mitocondrial en las células.

Para evaluar la citotoxicidad de las muestras proteicas de amaranto, se determinó la viabilidad celular en base a la integridad de la membrana plasmática por marcación con ioduro de propidio (IP) y citometría de flujo, a partir del siguiente procedimiento:

1. Obtención de monocapas de células Caco-2 TC7: Se sembraron 0,25 mL de una suspensión celular en placas de 24 pocillos (concentración final = 6,2 x 104 células/pocillo) y se incubó durante 72 h en estufa; posteriormente se retiró el medio y se lavó con PBS.

2. Tratamiento con muestras: El medio de cultivo se reemplazó con 0,25 mL de las muestras a estudiar solubilizadas en buffer fosfato 35 mM (pH 7,8) y se incubó en estufa durante 3 h (37 ºC, 5 %CO2). Se retiró la solución y se lavó con PBS. Las células fueron tripsinadas para su

desprendimiento y la suspensión celular fue transferida a tubos de citómetro. Además de los tubos con muestras se prepararon los siguientes sistemas control: • Control (-): se agregó buffer en lugar de muestra.

• Controles para la diferenciación entre células vivas y muertas: se prepararon tubos con mezclas de células vivas y células muertas, a algunos se agregó IP (control v/m con marca) y a otros no (control v/m sin marca). Las células muertas se obtuvieron por calentamiento a 55 ºC durante 20 min.

3. Evaluación de la permeabilidad de la membrana: A cada tubo se le agregó IP en una concentración final de 1 µg/mL. Se incubó durante 10 min y se realizaron las determinaciones de CDF. Se utilizó un Citómetro de Flujo Becton Dickinson FACScalibur (Plataforma de Citometría de Flujo de la Facultad de Ciencias Exactas, UNLP). Para la evaluación de los resultados se utilizó el programa FlowJo X 10.0.7; luego de seleccionar la población a estudiar en un gráfico SSC-H vs. FSC-H, se analizó la intensidad de fluorescencia en el canal FL3 (correspondiente a IP) para analizar el porcentaje de células vivas y muertas.