DISCIPLINARY RESPONSIBILITY 1 Enforcing disciplinary responsibility

muestra la inmunodetección de los IsR detectados con la sonda L2 y L1 respectivamente. El segundo panel corresponde al esquema interpretativo de las autoradiografías. En los paneles siguientes (i,ii,iii) se muestran las formas de los IsR esperados obtenidos mediante el programa de simulación 2DGels.

En la Figura 27B se muestra la inmunodetección y el correspondiente diagrama interpretativo del fragmento pYAC_MEM PvuI-PvuI, así como los patrones esperados de los IsR simulados con el programa 2D Gels. El tamaño del fragmento de estudio fue de 4682 pb y presentó en su estructura el ARS4 posicionado cerca del extremo izquierdo del mismo. La detección se realizó mediante la sonda L1. En el esquema interpretativo de la autoradiografía se representa en color rojo el arco de burbujas, en verde el arco de Y simples y en negro el arco de lineales. Al igual que en el apartado anterior, se asume que la iniciación de la replicación tuvo lugar de forma bidireccional desde el ARS4. En el primer panel (i) las horquillas viajan a la misma velocidad sin restricciones. La horquilla que se mueve en contra de las agujas del reloj, debido a la localización del ARS4, alcanza el extremo del fragmento con una masa aproximada de 1,43x, correspondiente a la transición de burbuja a Y simple y se indica en el diagrama con una flecha en color rojo. En el segundo panel (ii) se asume que la horquilla que se desplaza en el sentido de las agujas del reloj sufre un bloqueo temporal en CEN6 al igual que en el caso del estudio del fragmento pYAC_MEM BamHI-BamHI (Figura 27Aii). La re-entrada de la horquilla en el fragmento de estudio se produce con una masa aproximada de 1,75x. Por otro lado, como ya se ha mencionado anteriormente, la horquilla que se desplaza en el sentido de las agujas del reloj sufre una ralentización al alcanzar y sobrepasar el gen de histidina. El programa de simulación predice que la horquilla que se

120 desplaza en el sentido en contra de las agujas del reloj, a pesar de su bloqueo parcial, alcanza el extremo del fragmento más rápidamente que su homóloga produciéndose la transición de la señal de burbuja a Y simple con una masa de 1,91x, señalada mediante una flecha de color rojo. En el tercer patrón de replicación esperado (iii) se asume que la horquilla que se desplaza en el sentido en contra de las agujas del reloj se bloquea de forma permanente al alcanzar CEN6. La horquilla que se desplaza en el sentido de las agujas del reloj, por otro lado, continúa a velocidad constante hasta alcanzar el gen de histidina sufriendo una disminución de la velocidad a su paso y recuperándola al finalizar su replicación. Esta horquilla alcanza el extremo derecho del fragmento con una masa de 1,85x y cambia la señal de burbuja a simple Y. Debido a la circularidad del minicromosoma, la horquilla volvería a aparecer en el extremo izquierdo del fragmento en estudio, momento en el que ocurriría una nueva transición de Y simple a Y doble con una masa aproximada de 1,93x, señalada en el diagrama con una flecha de color azul.

Retomando la Figura 26C y D, faltaría por analizar los fragmentos digeridos con la combinación de enzimas: BamHI-SwaI y PvuI-PvuI, respectivamente. Ambos fragmentos de estudio presentan la particularidad de no poseer el origen de replicación ARS4, por lo que no se deberían visualizar arcos de burbujas pero si Y dobles que caracterizan las terminaciones de la replicación.

Comenzando por el fragmento pYAC_MEM BamHI-SwaI (Figura 28C), su inmunodetección se presenta acompañada del diagrama interpretativo y el análisis de los IsR esperados obtenidos mediante simulación con el programa 2D-Gels. El fragmento tiene un tamaño de 3432 pb y los patrones generados por los intermediarios de replicación se detectaron mediante hibridación con la sonda L2. En la ilustración interpretativa se presenta en color verde el arco de Y simples, en azul el arco de Y dobles y en negro el arco de recombinantes a la izquierda y el arco de lineales en la parte inferior. Además se señala en azul claro una región triangular por debajo del arco de Y dobles correspondiente a la zona indefinida de terminación de la replicación. Siguiendo la misma dinámica de interpretación realizada en la Figura 27 se muestran tres modelos de replicación correspondientes a las tres condiciones descritas con anterioridad.

En todos los casos se asumió que la iniciación de la replicación se produjo en el ARS4. En el primer panel (i) dada la localización del ARS4, el fragmento en estudio sería

121 replicado por una sóla horquilla que se mueve de derecha aizquierda generando IsR con forma de simple Y. En el segundo modelo (ii), el retraso temporal de la horquilla en CEN6 da tiempo a la otra horquilla a entrar en el fragmento por el extremo izquierdo lo que da lugar a una transición de Y simple a Y doble con una masa de 1,88x terminando la replicación sobre el arco de recombinantes. Debido a que el encuentro de las dos horquillas que viajan en direcciones opuestas ocurre con una masa muy cercana a 2x, se observa un aumento de la intensidad de la señal en esta localización sobre el arco de recombinantes. En el tercer modelo (iii) el progreso de la horquilla que se desplaza en contra de las agujas del reloj se detiene permanentemente en CEN6 por lo que esta horquilla no entra en el fragmento de estudio, siendo el fragmento replicado unidireccionalmente por la horquilla que se desplaza en sentido contrario dando lugar una Y simple completa.

Figura 28. Estudio de los IsR de los fragmentos pYAC_MEM BamHI-SwaI y pYAC_MEM PvuI-

PvuI. Células pYAC_MEM top2-td crecidas en presencia de Top2 y sincronizadas en G1 se recogieron a

los 40 minutos y se aislaron las formas replicativas. C. IsR de replicación del fragmento pYAC_MEM