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concentraciones de cloroquina

En el experimento anterior se pudo comprobar que la señal de los Cat Cs aparecía de manera súbita al final de la replicación. Para averiguar el tipo de superenrollamiento que albergaban estos encadenados se utilizaron diferentes concentraciones de cloroquina sólo durante la segunda dimensión de las electroforesis bidimensionales.

La cloroquina es un agente intercalante de la doble hélice de ADN que provoca un desenrollamiento parcial de la molécula en el sitio en el que se intercala. En el caso de plásmidos circulares con un superenrollamiento (-) nativo, la incorporación de cantidades

88 crecientes de cloroquina consiguen relajar las moléculas que incluso pueden llegar a adquirir superenrollamiento (+) (Bauer and Vinograd 1968). En la Figura 9 se muestran ejemplos del efecto de la cloroquina sobre el comportamiento electroforético de las formas superenrolladas cuando la droga se añade en primera, en segunda o en ambas dimensiones de un gel bidimensional.

Si sólo se añade cloroquina en la primera dimensión, el efecto de la misma se diluye en la segunda dimensión, por lo que la movilidad electroforética de las moléculas en la segunda dimensión vuelve a ser la correspondiente a su estado inicial, pero teniendo en cuenta el efecto provocado por la cloroquina en la primera dimensión (Figura 9B). En este caso se apreció una alta resolución de los encadenados de izquierda a derecha, afectando principalmente a los Cat Bs, los cuales se resolvieron mejor en primera dimensión respecto al control (Figura 9A), pero sin variar apenas su movilidad electroforética en segunda dimensión. En los monómeros covalentemente cerrados CCCs, especies que aparecen en la imagen por debajo de las OCs, fue donde mejor se apreció este efecto. Los monómeros que se encontraban inicialmente relajados adquirieron mayor movilidad electroforética en primera dimensión debido a la adquisición de superenrollamiento (+), migrando en segunda dimensión a la misma altura que las OCs al recuperar su estado topológico inicial. A partir de su localización en la imagen, en el punto más alto de la serie, a la derecha de las OCs, se diferenciaron monómeros con superenrollamiento (+) hacia la izquierda y (-) hacia la derecha.

En el caso de mantener la misma concentración de cloroquina en primera y segunda dimensión (Figura 9C), el efecto provocado en primera dimensión se mantiene en segunda dimensión. Las especies con una misma masa pero con diferente signo de superenrollamiento presentaron la misma movilidad electroforética, migrando en la misma posición. Este efecto se apreció tanto en los encadenados como en los monómeros dando la sensación de una imagen más compacta y de menor resolución.

En la Figura 9D se muestra el último supuesto en el que la concentración de cloroquina en segunda dimensión fue mayor que en primera. Las formas topológicas se resolvieron mejor en segunda dimensión migrando a diferentes alturas dependiendo del tipo de superenrollamiento. Además, al correr la primera dimensión en presencia de cloroquina, se sumaron los efectos de resolución en segunda dimensión, tanto de izquierda a derecha como de arriba abajo.

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Figura 9. Efecto de la cloroquina sobre la movilidad electroforética de las formas topológicas en la electroforesis bidmensional. Células de la estirpe top2-td en crecimiento exponencial se bloquearon con

α-factor en fase G1 y la proteína Top2 fue degradada. Las células se liberaron del bloqueo de forma sincrónica y se recogieron a los 80 minutos. Las electroforesis bidimensionales se realizaron en presencia de distintas cantidades de cloroquina. A. Inmunodetección del minicromosoma pRS316 en ausencia de cloroquina. B. Inmunodetección del minicromosoma en presencia de 0,50 µg/ml de cloroquina en primera dimensión. C. Inmunodetección del minicromosoma en presencia de 0,50 µg/ml de cloroquina en primera y segunda dimensión. D. Inmunodetección del minicromosoma en presencia de 0,50 µg/ml de cloroquina en primera y 20,00 µg/ml en segunda dimensión. A la derecha de cada imagen se muestra el esquema representativo, en color negro se muestran las señales de las formas no replicadas y en color verde, rojo y azul claro, los Cat Cs, Cat Bs y Cat As, respectivamente.

En los tres ejemplos se apreció que los encadenados de tipo A mostraron la misma movilidad electroforética en todos los casos, al igual que las OCs, al tratarse de moléculas relajadas que no albergan superenrollamiento.

A la vista de los diferentes efectos que produce la cloroquina en las distintas dimensiones, se decidió realizar las electroforesis bidimensionales en presencia de diferentes concentraciones de cloroquina en primera y segunda dimensión. Se eligió el tiempo de 40 minutos como el más representativo de la fase S y se analizó la población en presencia de concentraciones crecientes de cloroquina desde 0,10 µg/ml hasta 10,00 µg/ml.

90 En la Figura 10 se muestran las inmunodetecciones obtenidas, partiendo de una muestra intacta para observar la movilidad electroforética inicial de los Cat Cs y poder compararla con las que presentan las muestras expuestas a diferentes concentraciones de cloroquina. Bajas concentraciones de cloroquina, de 0,10 a 0,75 µg/ml, correspondientes a los 4 paneles superiores después del control sin cloroquina, no fueron capaces de movilizar significativamente la población de Cat Cs. En la imagen correspondiente a 1,00 µg/ml, segundo panel de la segunda fila, se apreció una disminución de la movilidad con respecto al control. A partir de esta concentración hasta 10,00 µg/ml la movilidad de los Cat Cs fue muy parecida.

Centrándonos en las formas CCCs monoméricas, desde la concentración de 0,10 µg/ml se apreció una disminución en la movilidad electroforética hacia el estado relajado. La concentración de 0,75 µg/ml consiguió movilizar las CCCs a la misma altura de las formas relajadas, OCs. A partir de esta concentración las CCCs adquirieron superenrollamiento (+), aumentando de nuevo su movilidad electroforética en segunda dimensión hasta la última concentración analizada, 10,00 µg/ml, en la que recuperaron su localización inicial.

Figura 10. Análisis de la movilidad electroforética de los encadenados del minicromosoma pRS316 en ausencia de Top2 durante la fase S del ciclo celular en presencia de cloroquina en segunda dimensión. Células de la estirpe top2-td en crecimiento exponencial se bloquearon con α-factor en fase

G1 y la proteína Top2 fue degradada. Las células se liberaron del bloqueo de forma sincrónica y se recogieron muestras a los 40 minutos. Se muestran las inmunodetecciones del minicromosoma pRS316 en presencia de distintas concentraciones de cloroquina en segunda dimensión desde 0,10 µg/ml hasta 10,00 µg/ml. A la derecha de cada fila de imágenes se muestra el esquema representativo de la muestra control, en color negro se indican las señales de las formas no replicadas y en color verde, rojo y azul claro, los Cat Cs, Cat Bs y Cat As, respectivamente.

91 Después de ensayar con ocho concentraciones diferentes de cloroquina no se pudo llegar a ningún resultado concluyente respecto a los cambios de la movilidad electroforética de los Cat Cs. Las formas monoméricas, por el contrario, mostraron cambios de movilidad coherentes dentro de la serie de cloroquina analizada.

A la vista de los resultados obtenidos se comprobó si comparando la movilidad de los Cat Cs a diferentes tiempos dentro de la fase S del ciclo celular: 30, 35 y 40 minutos. Se realizó en presencia de dos concentraciones diferentes de cloroquina en segunda dimensión para intentar detectar diferencias en la movilidad electroforética y de ello deducir el tipo de superenrollamiento que albergaban inicialmente.

Tomando como referencia los monómeros de la Figura 10, se eligieron las concentraciones de 1,00 µg/ml, que conseguía relajar totalmente la población, y 5,00 µg/ml de cloroquina, en la que las CCCs ya adquirían superenrollamiento (+).

Figura 11. Análisis de la movilidad electroforética de los encadenados del minicromosma pRS316 en ausencia de Top2 durante la fase S del ciclo celular en presencia de dos concentraciones de cloroquina en segunda dimensión. Células de la estirpe top2-td en crecimiento exponencial se

bloquearon con α-factor en fase G1 y la proteína Top2 fue degradada. Las células se liberaron del bloqueo de forma sincrónica y se recogieron muestras a los tiempos de 30, 35 y 40 minutos. Se muestran las inmunodetecciones del minicromosoma pRS316 a diferentes tiempos en presencia de concentraciones de cloroquina sólo en segunda dimensión de 1,00 µg/ml y 5,00 µg/ml. A la derecha de las imágenes se muestra un esquema representativo de la muestra control, en color negro se indican las señales de las formas no replicadas y en color verde, rojo y azul claro, los Cat Cs, Cat Bs y Cat As, respectivamente.

92 En la Figura 11 se observa que ninguna de las dos concentraciones de cloroquina en los tres tiempos estudiados consiguieron provocar el efecto deseado en la movilidad electroforética de los Cat Cs, como se apreció en el caso de las formas monoméricas.

Definitivamente, el estudio del cambio de la movilidad electroforética de los encadenados en presencia de concentraciones crecientes de cloroquina en segunda dimensión no permitió llegar a ninguna conclusión sobre el tipo de superenrollamiento que albergan estas especies durante la fase S del ciclo celular.

4.1.1.3 Estudio de la movilidad electroforética de los encadenados del minicromosoma