Con el objetivo de fraccionar los componentes presentes en el extracto para su posterior cromatográfico, el extracto redisuelto en agua se extrajo con n-hexano, n-butanol y éndose 4 fracciones. Las fracciones se concentraron hasta sequedad y se obtuvo 7% para n-hexano, 43% para n-butanol, 30% para la fracción de
a remanente. Los resultados del screening
toquí n la tabla 3.
uando analizamos la primera fracción (n-hexano), solo se obtienen resultados positivas ara el ensayo de sudan, indicativo de la presencia de ácidos grasos o sustancias pídicas. En esta fracción pudieran estar incluidos otros compuestos fundamentalmente steroides, también de naturaleza lipídica, aunque no se obtuvieron evidencias de su resencia a través del ensayo Lieberman-Burchard, pero dada su presencia en el extracto
edades, estos metabolitos pudieran ser extraídos con el n- fracción, lo cual deberá comprobarse con
presencia de saponinas, flavonoides, y otros compuestos fenólicos, así como s.
análisis
acetato de etilo, obteni
acetato de etilo y 20% para la fracción acuos fi mico se muestran e C p li e p
acuoso original y sus propi
hexano y por tanto estar presentes en dicha otros estudios mas precisos.
La fracción n- butanólica resultó una de las fracciones más complejas desde el punto de vista fitoquímico, pues se obtuvieron resultados positivos para el ensayo de shinoda, espuma, liebermann-Burchard, cloruro férrico y Fehling, demostrando la
azúcares y compuestos relacionado
En el caso de la fracción de acetato de etilo, menos compleja que la anterior, se observaron evidencias positivas para flavonoides y compuestos fenólicos.
Tabla 3. Resultados del tamizaje fitoquímico realizado al extracto acuoso y las fracciones obtenidas del proceso extractivo
Ensayos Metabolitos Extracto Acuoso Fracción n- butanólico Fracción acetato de etilo Fracción acuosa remanente Espuma Saponinas + + - - Liebermann- Burchard Esteroides y/o triter + + - + penos
Cloruro Fenoles y/o + Fe
ferrico taninos noles (+) + Taninos (+)
Dragendorff Alcaloides + - + Sudan Ácidos grasos + - - + Fehling Azúcares + + - ++ Shinoda Flavonoides + + + +
Cuando se analizaron los resultados de este estudio con respecto a los flavonoides, como sustancia de interés, se observó que estos estaban presentes en 2 de los fracciones evaluadas (n-butanólica, acetato de etilo) aunque resultaron mas abundantes en la fracciones n-butanólica, presumiblemente de tipo flavona, flavonol, o flavanona según las evidencias descritas para el ensayo de Shinoda. Según los resultados obtenidos, las saponinas parecen estar acompañando a los flavonoides fundamentalmente en el extracto n-butanólico lo cual es lógico pues este disolvente es descrito también para este tipo de metabolito (Mabry, 1978).
ractos de origen vegetal, ya sea en materias primas,
produc s terminados o com re oló técnicas
cro as e ltados la se
a s de s indiv ales.
P on valuar caracter cas crom gráficas de las fracciones
obtenidas en el fraccionamiento líquido- líquido se aplicó la cromatografía de capa delgada, empleando en todos los casos placas de sílica gel como fase estacionaria y las La fracción acuosa contiene mayoritariamente compuestos fenólicos posiblemente taninos ya informados para la planta en cantidades apreciables (Moráis y colaboradores, 1999 y Tejeda, 1998), así como compuestos reductores, los cuales pueden estar en forma glícosídica o en su forma libre, dado la apariencia que se observó en el extracto, lo cual es característico de los extractos ricos en carbohidratos (Miranda y Cuellar, 2001).
3.3.1 Evaluación cromatográfica de las fracciones
El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis cualitativo y uantitativo de materiales o ext
c to puestos p nos resu sentes en en fluidos bi
paración óptima, identificación y gicos. Las
matográfic han dado bu
islamiento componente idu
fases móviles que se indican en el s velaro V (λ 254- 366nm) y con otros reveladores que muestran unas respuestas específicas atendiendo al t metabo s como la vainillina y anisaldehido sulfúrico (Ol , 1996), para terpenos y tricloruro de aluminio para los flavonoides (Markhan, 1988).
F e n-h
a fracción obtenida por extracción con n- hexano se eluyó con cloroformo, observándose una buena resolución en el cromatograma.
rvaron manchas típicas de terpenos, todas de color pardo amarillentos al ultravioleta pero con de azul hasta el violeta con el revelador, siendo la mancha correspondiente al o), en este caso se considera que
e en este extracto no está presente este tipo acápite 2.3. Las placas e re n bajo luz U
ipo de lito, tale ivo
racción d exano L
F.E.: silica gel 60 F.M.: Cloroformo
Cromatograma de la fracción n-hexano eluida en cloroformo
Los resultados cromatográficos muestran 6 manchas con adecuada separación observables tanto al visible como al ultravioleta, frente al anisaldehido se obse
tonalidades
compuesto 4 la de reacción mas intensa (color violáce
dichos compuestos están estructuralmente relacionados con los terpenos o esteroides, lo cual corroboró lo anteriormente expuesto para el epígrafe 3.3, debiéndose profundizar en los estudios con esta fracción.
Para el revelado con tricloruro de aluminio, no se observaron cambios significativos en el cromatograma por lo que puede inferirse qu
de metabolito. Considerando lo interesante de la fracción esta quedó pendiente para futuros trabajos fitoquímicos.
Fracción de n- butanol
Para el desarrollo cromatográfico de esta fracción los mejores resultados se muestran en la siguiente figura.
O:MeOH
Cromatograma de la fracción n-butanol eluida en acetato de etilo: metanol acético: FM: (Ac)2 (85: 15) FM: BAW (40:10:50) y en BAW En el caso de la fase móvil n-butanol: ácido agua, se observó mejor resolución que para la fase móvil acetato de etilo: metanol (85:15) pues se observó la poca retención de los metabolitos en dicha fase. Al ser con anisaldehido las manchas se
tornaron oscura ucede para el
caso de la vainillina, por lo que se pudo descartar la presencia de terpenos al menos bajo
n de acetato de etilo se emplearon cuatro fases móviles,
l (85:15), (70:30) y (80:20) - diclorometano: metanol (85:15)
reveladas
s pero no con la coloración rosada violácea típica, igual s estas condiciones.
Sin embargo al revelar con el tricloruro de aluminio en ambas fases móviles se observaron manchas fluorescentes al UV 366 de color amarillo verdoso típicas de flavonas y flavanonas (Lock de Ugaz, 1988) y otras de color azul intenso que pudieran estar relacionadas con estructura tipo flavonoide o tipo coumarina (Wagner and Bladt, 1996). Fracción acetato de etilo
Para la evaluación de la fracció en diferentes proporciones:
- metanol: cloroformo (2:1); (2:1.5) - acetato de etilo: metano
- n-butanol: acido acético: agua (40:10:50) (BAW)
los reveladores y los valores de Rf.
Fase móvil metanol: cloroformo
Para las condiciones descritas se analizó el número y color de las manchas, las respuestas frente a
Los resultados cromatográficos se observan en la siguiente figura
F.M.:MeOH: CHCl3 (2:1) F.M.:MeOH: CHCl3 (2:1.5)
Cromatograma de la fracción acetato de etilo eluida en metanol: cloroformo
Para esta fase móvil no se observó buena separación de las manchas para ninguna de las dos proporciones evaluadas, quedando en ambas retención en el punto de aplicación, lo
n sueltos; para la segunda proporción (2:1.5), se evidencia la presencia de tres manchas, dos de color amarillo que al ser revelados con tricloruro de sas que antes del revelado, aunque tal la literatura para este tipo de compuesto. Similar
com o do los resultados anteriores se
cual se observó también al ser revelado con anisaldehido y tricloruro de aluminio. En el primer caso, proporción (2:1) se observó solo dos manchas una de las cuales da color amarillo con el tricloruro de aluminio, lo cual podía sugerir la presencia de compuestos tipo flavonoide, aunque lo irregular de la mancha indicó la posible presencia de más de u compuesto escasamente re
aluminio resultaron amarillo verdoso. Con el anisaldehído dichas manchas resultaron también de color amarillo, más inten
comportamiento no aparece descrito en
dec ióid continuar la investigación solo empleando el tricloruro de aluminio como solución reveladora pues nos brindaba información mas precisa.
Fase móvil acetato de etilo: metanol
Los resultados cromatográficos aparecen representados a continuación
F.M.: acetato de etilo: metanol (80:20)
Cromatograma de la fracción acetato de etilo eluida en acetato de etilo: metanol El cromatograma para esta fase móvil most
cloroformo: metanol, en particular la proporción (80:20). Aunque para todos los casos en ró mejores resultados que para la fase esta fase móvil el comportamiento frente al tricloruro de aluminio fue semejante, en todas no se observó el mismo grado de resolución, es en la proporción (80:20) donde apareció como una mancha definida a Rf 0,4. El resto de las proporciones evaluadas para esta fase móvil no mostraron un buen desarrollo cromatográfico al quedar componentes retenidos en el sitio de aplicación con diferentes grados de intensidad, donde aparecieron compuestos con revelado típico de flavonoide.
Fase móvil diclorometano: metanol (85: 15)
En el caso de esta fase móvil no se observó ninguna separación de las manchas pues la muestra punteada quedó retenida en el punto de aplicación, lo cual evidencio que no es una fase móvil adecuada para separar los metabolitos presentes en la muestra.
Fase móvil n-butanol: acido acético: agua (BAW) (40:10:5)
F.M.: BAW (4:1:5)