En la figura 4.17 se aprecian los resultados de la calibración PLS. El error RMSEP es de 127.17 mg/100 ml. Cabe recordar que este error se ha incrementado debido al error del método de referencia y debido a la variación de la componente continua. El promedio del error máximo posible en las mediciones de referencia es de 67.67 mg/100 ml (ver tabla 4.3). Es decir, el método podría tener un error de alrededor de 60 mg/100 ml, pero para afirmar ello se requiere de un nuevo experimento con métodos de referencia más precisos.
Por otro lado, la calibración efectivamente se basa en la glucosa como puede observarse en la figura 4.18.
Figura 4.17: Calibración PLS obtenida a partir de los datos obtenidos con el método del promedio.
Figura 4.18: Vector de regresión del modelo PLS. Se observan claramente los peaks de la glucosa en el vector de regresión lo que indica que la calibración se basa
efectivamente en la glucosa.
En la figura 4.19 se evalúa la utilidad clínica de los datos. De los 9 datos que tienen una concentración de referencia <400 mg/100 ml, sólo 5 caen dentro del gráfico. De esos 5, 3 caen en la zona A, 0 en la B, 0 en la C, 1 en la D y 1 en la E. Estos resultados son claramente inaceptables clínicamente hablando. Es importante mencionar que esto no se debe a la imprecisión del método de referencia, pues dicho error es despreciable en los rangos cubiertos por el gráfico.
Ahora, para medir la máxima precisión posible se anuló el efecto de la variación de la componente continua calibrando el modelo con la concentración real de cada muestra, es decir, con el promedio de la concentración mínima y máxima de la tabla 4.2. El RMSEP fue de 101.03 mg/100 ml como se observa en la figura 4.20. Tomando en cuenta el error de referencia, la calibración podría tener un error de alrededor de 30 mg/100 ml, pero nuevamente, para afirmar ello se requeriría de un nuevo experimento con mediciones de referencia más precisas.
Figura 4.19: Datos de validación sobre el gráfico de error de Clarke.
Figura 4.20: Calibración PLS obtenida a partir de los datos obtenidos con el método del promedio sin el efecto de la variación de la concentración de la componente continua.
En la figura 4.21 se graficaron los resultados de la validación sobre el gráfico de error de Clarke. De los 11 datos con concentración <400 mg/100 ml, sólo 6 caen dentro del gráfico. De esos 6, 1 cae dentro de la zona A, 2 en la zona B, 1 en la zona C, 0 en la D y 2 en la E lo que sigue siendo clínicamente inaceptable.
Figura 4.21: Datos de validación sobre el gráfico de error de Clarke.
Finalmente se calibró un modelo pero usando sólo 22 espectros, todos los disponibles con concentraciones bajo 400 mg/100 ml. El error RMSEP fue de 41.16 mg/100 ml, tal como se observa en la figura 4.22. El error de las mediciones de referencia es despreciable en este caso. En la figura 4.23 se puede observar el vector de regresión que sugiere que la calibración se basa, al menos en parte, en el espectro de la glucosa. Este se observa con una menor razón SNR que el de la figura 4.18 debido a las menores concentraciones que se están midiendo.
La utilidad clínica de los datos se observa en la figura 4.24. De los 11 espectros, 7 caen en la zona A y 4 en la B. Es decir, en este caso, los resultados son clínicamente benignos. Sin embargo, de acuerdo a la Organización Internacional para la Estandarización (ISO), el 95% de las mediciones determinadas por un monitor de
glucosa deben tener un error <15 mg/100 ml, cuando los niveles de glucosa son <75 mg/100 ml, o <20% cuando los niveles de glucosa son >75 mg/100 ml para poder ser utilizados por diabéticos (International Organization for Standardization, 2003). En este caso, esto no se está cumpliendo, pues los datos que cayeron en la zona B tienen un error mayor al 20%.
Figura 4.22: Calibración PLS obtenida a partir de los espectros de bajas concentraciones con el método del promedio sin el efecto de la variación de la concentración de la
componente continua.
Debido a que el error de los modelos PLS escala aproximadamente de manera lineal con el SNR de los espectros (Berger & Feld, 1997), se podría obtener un RMSEP de aproximadamente 13.72 mg/100 ml y el 100% de los datos en las zonas A y B con un incremento de alrededor de 3 veces en el SNR. Para obtener dichos resultados, además de incrementar la razón SNR de los espectros, lógicamente se deben usar mediciones de referencia de alta precisión.
Figura 4.23: Vector de regresión del modelo PLS. Si bien el nivel de ruido es bastante alto, se observa la alta importancia de las variables entre los 400 y 600 cm-1, donde se ubican ciertos peaks de la glucosa, lo que permite afirmar que la calibración se basa, al
menos en parte, en la glucosa.
4.4.2.2 Resultados con el método del filtrado en frecuencia
En la figura 4.25 se aprecian los resultados de la calibración PLS. El error RMSEP es de 1770.94 mg/100 ml. Nuevamente, el promedio del error máximo posible en las mediciones de referencia es de 67.67 mg/100 ml (ver tabla 4.3). Es decir, el método podría tener un error de alrededor de 1700 mg/100 ml, pero para afirmar ello se requiere de un nuevo experimento con métodos de referencia más precisos.
En la figura 4.26 se aprecia el vector de regresión del modelo. Si bien es bastante ruidoso, se observan con claridad las bandas Raman de la glucosa ubicadas entre los 400 y 600 cm-1.
Figura 4.25: Calibración PLS obtenida a partir de los datos obtenidos con el método del filtrado en frecuencia.
En este caso no vale la pena usar el gráfico de error de Clarke ya que el nivel de error del modelo está por lejos sobre lo clínicamente aceptable. Además debido a la gran mejora en SNR que sería necesaria para poder utilizar este método es difícil hacer una predicción acerca del orden de incremento necesario.
Figura 4.26: Vector de regresión del modelo PLS. Se observan claramente los peaks de la glucosa ubicados entre los 400 y 600 cm-1 lo que indica que la calibración se basa
efectivamente en la glucosa.
Figura 4.27: Calibración PLS obtenida a partir de los espectros de bajas concentraciones obtenidos con el método del filtrado en frecuencia.
Una calibración usando sólo las muestras con concentración <400 mg/100 ml se observa en la figura 4.27. En esta figura se comprueba que el modelo esta sobre ajustado y, además, no logra predecir las concentraciones de datos independientes (𝑅𝑃2=0.039). Esto se debe a que el SNR de los espectros producidos por el método de filtrado en frecuencia no es suficiente como para medir concentraciones tan pequeñas.
5. CONCLUSIONES
La concentración de glucosa de una solución acuosa puede ser medida efectivamente mediante la utilización de un espectrómetro portátil, como el MiniRam. La validación del modelo PLS calibrado en base a los datos procesados con el método del promedio, arrojó un R2 de 0.999 con un RMSEP de 127.17 mg/100 ml cuando se usó el rango completo de concentraciones (50 a 15600 mg/100 ml) y un R2 de 0.854 con un RMSEP de 41.16 mg/100 ml cuando se usaron sólo las muestras entre 0 y 400 mg/100 ml que es el rango de concentraciones encontrado habitualmente en la sangre. Un R2=0.999 indica claramente que la técnica Raman es capaz de medir la concentración de glucosa de manera no invasiva. Además, picos correspondientes a las bandas Raman de la glucosa aparecen en los vectores de regresión de los modelos lo que sostiene que las predicciones efectivamente se basan en la glucosa. Sin embargo, de acuerdo a la Organización Internacional para la Estandarización (ISO), el 95% de las mediciones determinadas por un monitor de glucosa deben tener un error <15 mg/100 ml, cuando los niveles de glucosa son <75 mg/100 ml, o <20% cuando los niveles de glucosa son >75 mg/100 ml para poder ser utilizados por diabéticos (International Organization for Standardization, 2003). Esto y el uso del gráfico de error de Clarke demuestran que el nivel de error alcanzado por el método del promedio es todavía ligeramente superior al necesario para aplicaciones clínicas.
Los niveles de error de una calibración PLS escalan de manera aproximadamente lineal con el SNR de los espectros adquiridos (Berger & Feld, 1997). Considerando los niveles de error alcanzados por el método del promedio, se necesitaría una mejora de alrededor de 3 veces en el SNR de los espectros para alcanzar el rango de error clínicamente aceptado. Sin embargo, el SNR debe ser aumentado aún más si se pretende aplicar el método in vivo, pues debido a la piel, la fluorescencia de ciertos compuestos de la sangre y otras interferencias, el SNR de los espectros sería mucho menor que la de los adquiridos de una solución acuosa dentro de una cubeta como se hizo en esta tesis.
frecuencia alcanzó un R2 de 0.892 y un RMSEP de 1770.94 mg/100 ml, lo que es aproximadamente 14 veces peor que el método del promedio. Esto se debe, entre otras razones, a que él método detecta sólo la componente alterna, la que es menos intensa que la componente continua. Es decir, al detectar sólo la glucosa presente en la sangre se muestrea una menor cantidad de señal con un mismo nivel de ruido llevando a un error mayor. La mejora en el SNR para que el método del filtrado en frecuencia alcance niveles de error clínicamente aceptables midiendo la concentración de glucosa en una solución acuosa es difícil de estimar debido a su gran magnitud, pero se estima que debiera ser de alrededor de 40 veces. Sin embargo, para su aplicación in vivo este valor tendría que ser, lógicamente, aun mayor. Por esto, a no ser que se tenga un espectrómetro y una sonda con niveles SNR muy altos, la ventaja de detectar sólo la glucosa presente en la sangre a través del método de filtrado en frecuencia, se ve sobrepasada por el menor SNR de los espectros producidos.
Finalmente, este estudio demuestra que la espectroscopía Raman es una técnica promisoria para la medición in vivo e in vitro de concentraciones de glucosa si se logra mejorar el SNR de los espectros. Esta mejora puede ser lograda incrementando la potencia del láser, aumentando el área y ángulo sólido de colección (Tanaka et al., 1996), usando CCDs enfríados por nitrógeno líquido, etc. En (Koo, 2001), por ejemplo, logran incrementar en un factor 4 la SNR de un sistema que ya era de muy alto rendimiento, por lo que el margen de mejora para un equipamiento como el usado en esta tesis es inmenso. De hecho, una investigación del MIT (Enejder et al., 2005), midió los niveles de glucosa en seres humanos de manera in vivo utilizando un espectrómetro Raman de laboratorio con un alto SNR y utilizando el método del promedio logró obtener un error absoluto medio (MAE) para cada persona de 7.8% ± 1.8% con un R2 de 0.83 ± 0.10, lo cual es clínicamente aceptable. Esto quiere decir que si la tecnología presente en estos sofisticados equipos de laboratorio logra ser incorporada en los equipos portátiles a un costo reducido, la medición in vivo portátil podría ser una realidad en un futuro cercano.
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