• Recuento inicial de inóculo: El inóculo inicial se mantuvo en 106 UFC/mL en las condiciones establecidas inicialmente para cada cepa. Se realizó coloración de Gram para verificar pureza como se observa en la Tabla 5, en donde se evidenció la morfología característica de esta levadura sin contaminación.
Tabla Nº 5. Coloración de Gram y valores de absorbancia620 nm de inóculos de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
Cepa Microscopía observada a partir de la coloración de Gram
Absorbancia del inóculo
620nm
A Levaduras sin contaminación microbiana 0.866
B Levaduras sin contaminación microbiana 0.874
Después del período de incubación, en el agar YPG, se evidenciaron colonias grandes de aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos y brillantes.
Los recuentos obtenidos se observan en la Tabla 6.
Tabla Nº 6. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de Cepa A (estudio) y Cepa B (control)
CEPA UFC/mL
A 2,20E+07 B 1,50E+07
• Recuentos de prueba de tolerancia a jugos gástricos: de cada una de las cepas se realizaron recuentos durante 24 horas, tomando muestras a la hora 0, 1, 2, 4 y 24; del jugo gástrico de pH 2.0 – 2.3 y del control (jugo gástrico pH 7.0 -7.2)
4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Tiempo de muestreo (h) Lo g ( U F C /m L) Cepa A Cepa B
Figura Nº 14. Recuentos (UFC/mL) en Jugos Gástricos de pH 2.0 – 2.3 para Cepa A (estudio) y Cepa B (control)
Para el caso de estudio, la cepa control (B) y la cepa estudio (A) presentaron una buena viabilidad (105 UFC/mL) durante el tiempo de muestreo (hora 0 hasta hora 24) para el jugo gástrico artificial de pH 2.0-2.3, resultados que se observan en la Figura 14 y Anexo Nº 5.
Los recuentos obtenidos en las 4 primeras horas de muestreo, permanecieron similares para ambas cepas (siendo ligeramente mayor para la cepa B), ya que no se observó una diferencia estadísticamente significativa entre ambas cepas (p >0.05) sin embargo, la cepa en estudio tuvo recuentos superiores a partir de la cuarta hora de mantenimiento en condiciones simuladas para jugos gástricos y para la hora 24 este valor siguió aumentando como se observa en la Figura 12, resultados que al ser comparados con el estudio realizado por Fietto et al (2004) en el que al exponer las levaduras (S. cerevisiae y S. cerevisiae var boulardii) a jugos gástricos por un tiempo de 60 minutos, no se observaron diferencias en la viabilidad de las cepas, sin embargo, después de 15 minutos, S. cerevisiae var boulardii presentó mayor resistencia, incluso manteniendo la viabilidad en un 75%, mientras que S. cerevisiae presentó una disminución cercana al 30% después de 60 minutos; demuestran que la cepa en estudio presenta una muy buena resistencia a jugos gástricos, porque incluso a las 24 horas de incubación, pudo mantener su metabolismo y la pérdida de viabilidad no fue drástica (105 UFC/mL). Este autor notó que las levaduras (S.cerevisiae var. boulardii) expresan proteínas específicas en respuesta a condiciones de estrés, incluida la resistencia a jugos gástricos, lo que sugiere la relación con la adaptación celular y la sobrevivencia en este ambiente (Fietto et al, 2004).
Estos resultados, tienen correlación con los datos observados en la Figura 10 para la prueba de tolerancia a rangos de pH, ya que S. cerevisiae var. boulardii (control), presentó un menor crecimiento hasta pH de 4.5, comparada con la cepa estudio, deduciendo que la levadura nativa, presenta mejores mecanismos de resistencia a condiciones adversas como valores ácidos de pH, a pesar de que la levadura administrada en una sola dosis, se aloja y permanece en el tracto gastrointestinal, pero en concentraciones menores (5 x 107 células/g heces) a las que se albergan en los microorganismos naturales de la flora intestinal dominante, lo que demuestra la capacidad de esta levadura para adaptarse a las condiciones fisicoquímicas del medio (Bunts, 2005).
La primera barrera que un microorganismo tiene que atravesar después de ser ingerido es un pH extremadamente ácido, producto de la digestión gastrointestinal. El jugo gástrico que es secretado diariamente posee un pH de aproximadamente 2.0 y la resistencia a un pH bajo como se explicó anteriormente pudo deberse a la presencia de antiportadores que ayudan al
intercambio de cationes monovalentes a través de las membranas, regulando el pH a nivel citoplasmático y de organelos, así como de una ATPasa la cual cumple con la misma función (Thomas, 2002).
Adicionalmente, el jugo gástrico presenta una concentración de sales de aproximadamente 0,5% (p/v), que generan la activación de mecanismos de resistencia como los mencionados en el numeral 6.2, debido a proteínas de membrana que internalizan estas sales y a vacuolas que participan en su posterior degradación. Esta secreción presenta a su vez una barrera enzimática compuesta principalmente por enzimas proteolíticas; todos estos factores forman una barrera que puede llegar a ser letal para la mayoría de los microorganismos (Martins et al, 2005). Debido a lo anterior, si un organismo sobrevive a estas condiciones extremas se puede considerar que puede llegar a tener potencial para ser usado como probiótico. 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Tiempo de muestreo (h) Log ( U FC /m L) Cepa A Cepa B
Figura Nº 15. Recuentos (UFC/mL) en Jugos Gástricos de pH 7.0 – 7.2 para Cepa A (estudio) y Cepa B (control)
A diferencia de los resultados obtenidos anteriormente, para el jugo gástrico control de pH 7.0-7.2, se observó un mayor crecimiento de la cepa B, comparada con la A, como se observa en la Figura 15 y en el Anexo Nº 4. Sin embargo, no se observó una diferencia estadísticamente significativa (p > 0.05) entre ambas cepas. En las primeras horas los recuentos se mantuvieron similares para cada cepa, sin embargo, desde la hora 4 la cepa control incrementó su viabilidad, mientras que la de la cepa estudio se mantuvo estable, lo que confirmó que la cepa control (S. cerevisiae var. boulardii), crece mejor en pH cercanos a
la neutralidad, ya que en condiciones ácidas se disminuye su viabilidad, comparado con la cepa en estudio que tanto en el jugo gástrico de pH 2.0 – 2.3 como en el control de pH 7.0 – 7.2, mantuvo su viabilidad en valores similares, sin observarse diferencias en los recuentos (UFC/mL) obtenidos, como se reporta en el Anexo Nº 5.