e N Results and Damping Due to Vibrational Relaxation

El consorcio Microorganismos Eficaces presenta como característica principal que su solución es de pH ácido, entre 5 y 6, lo que permite el desarrollo de las bacterias ácido lácticas, bacterias fotosintéticas y los actinomicetos que componen este producto. Se ha reportado que los Microorganismos Eficaces han sido reportados para la bioremediación de suelos contaminados a través de la fijación, vía quelatización, de metales pesados y residuos de agroquímicos (Higa, 1997, pág. 12).

Para realizar la presente investigación primero se tuvo que adaptar el pH del consorcio EM 1 a un pH superior a 10, que es lo que asegura que la solución de NaCN usada para este trabajo, no se pierda por volatización y pueda enfrentarse a los Microorganismos Eficaces a concentraciones de 100, 200 y 300 ppm de NaCN, para medir su capacidad de biodegradación.

Para realizar la adaptación, se trabajó primero con una muestra de microorganismos eficaces proporcionada por la empresa BIOEM Perú, se realizó la medición del pH inicial de la muestra, la que reportó un pH de 3.5. Para asegurar que el consorcio rompa la latencia del envase de comercialización, este tuvo que ser activado en Agar Melaza, el mismo que se elaboró con los siguientes componentes: Melaza (5%), KH2PO4 (0,3%), MgSO4.7H20 (0,02%), NH4Cl (0,1%), Agar agar (1,5%), en agua destilada. Se cultivo por siembra en camada, en frascos de Roux y se incubaron a 30° C por 5 a 7 días. Luego se utilizó, una suspensión de melaza, para colectar los microorganismos desarrollados en el agar melaza y se obtuvo una “suspensión madre de microorganismos eficaces” (SMME)

La “suspensión madre de microorganismos eficaces” reportó un pH inicial de 5.5. Para realizar la adaptación a pH alcalino, se utilizó una solución de NaOH 0.5 M, la misma que fue siendo agregada en volúmenes de 1 ml/ dia, a un frasco de 200 ml. de SMME, al aplicar la solución alcalina, se pudo apreciar un aumento del pH en la solución, llegando a los 7 días a contar con una “suspensión madre de microorganismos eficaces”,

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adaptada a un pH, superior a 10, se realizó un recuento de UFC del consorcio adaptado y se pudo apreciar que existían 2.54 x 1010 UFC/ml, las mismas que presentaban movilidad al microscopio óptico, esto demostró que los microorganismos cuando son expuestos a cambios en las condiciones de pH, son capaces de realizar cambios en su ruta metabólicas y morfología y adaptarse a las nuevas condiciones, esto coincide con lo reportado por Hernández, L (2010) que indicó que en las pruebas preliminares de tolerancia al NaCN se seleccionaron valoraciones de pH de 9.3 y 9.6 para un aislado Pseudomonas sp, con la intención de evitar pérdidas del cianuro de sodio por volatilización en forma de HCN, a estos pH el microorganismo conservó su capacidad de división celular y producción de pigmento piocianina, adaptándose al medio con un cambio en su morfología, (de formas típicas bacilares pH 7.0 a formas cocobacilares pH de 9.3 y 9.6) favoreciendo la toma de C y N. El pH en los medios con agua destilada fue ajustado con solución de NaOH 1N, en este medio el pH variaba a través del tiempo y el cianuro se constituía como la única fuente de carbono para el microorganismo.

Se aplicaron pruebas para ir sensibilizando la suspensión madre de microorganismos eficaces para llevar el pH a niveles superiores 10, a la presencia de NaCN, por lo que se cultivó la suspensión madre en Agar melaza, luego de 4 días de incubación, se recogieron muestras de EM 1, con una solución de NaCN 10 ppm, la misma que también fue incubada por espacio de 4 días. Luego se procedió de manera ascendente con la concentración de cianuro, esto se realizó con la finalidad de ir adaptando a los EM 1 a la presencia de la molécula de – CN y que los mismos puedan ir produciendo las modificaciones morfológicas y enzimáticas que se necesitarían para biodegradar el NaCN. Al respecto, Garcés et al (2006, pág 4) realizaron la selección de los microorganismos más eficientes en la biodegradación de cianuro incubando los consorcios en caldo nutritivo incrementando la concentración de cianuro de potasio desde 2x10-4 ppm hasta 2.000 ppm. Todo el proceso se realizó en condiciones aerobias y anaerobias. Posteriormente el caldo nutritivo fue reemplazado paulatinamente por medio mínimo mineral, con 2.000 ppm de cianuro de potasio como fuente de carbono y nitrógeno. Se realizaron recuentos diarios de las UFC y el pH de la muestra adaptada a NaCN (ver anexos Nº 27 al 32).

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Con la solución de EM 1 adaptada se procedió a elaborar el diseño experimental que incluía, la formulación de tres soluciones de NaCN a concentraciones de 100, 200 y 300 ppm. y de tres concentraciones de EM 1 a 5, 10 y 15 %, con la finalidad de medir el efecto de la concentración de NaCN y EM 1 en la biodegradación de cianuro. Para cada tratamiento se trabajó con tres repeticiones y un testigo, el tiempo de duración de la prueba fue de 6 días, tomándose muestras a los 3 días y a los 6 días.

En la solución testigo, que sólo contenía agua y NaCN a la concentración establecida, se pudo apreciar que los niveles de cianuro, también disminuían en el biorreactor testigo. Así tenemos que para la concentración de 100 ppm, se observó que el testigo con EM 1 disminuyó su concentración de NaCN desde 121.3 a 112,5 ppm. De la misma forma la concentración de 200 ppm, se observó que el testigo con EM 1 disminuyó su concentración de NaCN desde 223.6 a 207.3 ppm, y también en la concentración de 300 ppm, se observó que el testigo con EM 1 disminuyó su concentración de NaCN desde 313,7 a 285,2 ppm., esto se puede explicar debido a la presencia de oxígeno en el interior del biorreactor, ya que se utilizó un volumen de 200 ml por cada unidad experimental para un matraz de 500 ml, el cual fue cerrado con papel metálico, con la finalidad de evitar la oxidación natural del NaCN. Pero al existir presencia de O2 al interior del biorreactor se aprecia una disminución de cianuro por oxidación natural.

Garcés et al (2006, pág 4) indican que el crecimiento de los consorcios bacterianos en todas las fases del proceso de biodegradación de cianuro, ocurre en condiciones aerobias como anaerobias. Los resultados indicaron que el proceso de biodegradación del cianuro es aerobio, sin embargo el crecimiento fue menor en condiciones anaerobias degradándose principalmente en tiocianato.

Se calculó la biodegradación producida por los microorganismos eficaces, restándole a las muestras (promedios), los valores de reducción de cianuro del ensayo testigo, esta corrección se pueden apreciar en las tablas Nº 18 a la 26 (Ver anexos), donde se muestran: la biodegradación de NaCN sin corregir, la biodegradación de NaCN, corregido (menos la biodegradación del testigo), y la biodegradación del anión CN- (peso molecular del cianuro).

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En la tabla Nº 02 puede apreciar los valores de biodegradación de NaCN a una concentración de 100 ppm., trabajando con concentraciones de 5, 10 y 15 % de EM 1. En estos resultados se puede apreciar que a concentración de 5% a los 6 días del ensayo, se obtuvo una reducción de NaCN de 10.76 ppm, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 8.6 %; al aumentar la dosis de EM 1 a 10% se puede apreciar que aumenta la reducción de NaCN a 23.89 ppm a los 6 días de iniciado el ensayo, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 19.2 %; y finalmente cuando se trabajó con concentración de 15% de EM 1, se obtuvo una reducción de NaCN de 20.81ppm. a los 6 días de iniciado el ensayo, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 16.8 % (Gráfico Nº 2). En estos resultados se puede apreciar que al aumentar la concentración de EM1 de 5% a 10 % se observa también un aumento de la biodegradación de 8.6 a 19.2 %, pero al aumentar la concentración de EM1 de 10 a 15 % se observa una leve disminución de la biodegradación de 19. 2 a 16.8 %.

Respecto a la concentración de 200 ppm de NaCN (tabla Nº 03) , se puede apreciar que a concentración de 5% de EM 1 a los 6 días del ensayo, se obtuvo una reducción de NaCN de 4.6 ppm, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 6.7 %; al aumentar la dosis de EM 1 a 10% se puede apreciar la reducción de NaCN fue de 3.08 ppm a los 6 días de iniciado el ensayo, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 5.2 %; y finalmente cuando se trabajó con concentración de 15% de EM 1, se obtuvo una reducción de NaCN de 2.3 ppm. a los 6 días de iniciado el ensayo, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 0.7 % (Gráfico Nº 3).

En estos resultados se pude apreciar que al aumentar la concentración de EM1 de 5% a 10 % se observa una leve disminución de la biodegradación de 6.7 a 5.2 %, pero al aumentar la concentración de EM1 de 10 a 15 % se observa una caída de la biodegradación de 5. 2 a 0.7 %.

Finalmente a concentración de 300 ppm de NaCN (tabla Nº 04) , se puede apreciar que a concentración de 5% de EM 1 a los 6 días del ensayo, se obtuvo una reducción de NaCN de 10.02 ppm, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 3.2 %; al

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aumentar la dosis de EM 1 a 10% se puede apreciar la reducción de NaCN fue de 13.10 ppm a los 6 días de iniciado el ensayo, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 4.2 %; y finalmente cuando se trabajó con concentración de 15% de EM 1, se obtuvo una reducción de NaCN de 4.6 ppm. a los 6 días de iniciado el ensayo, lo cual representa un porcentaje de biodegradación de 1.5 % (Gráfico Nº 4). En estos resultados se pude apreciar que al aumentar la concentración de EM1 de 5% a 10 % se observa un aumento leve de la biodegradación de 3.2 a 4.2 %, pero al aumentar la concentración de EM1 de 10 a 15 % se presenta una caída de la biodegradación de NaCN de 4.2 a 1.5 %.

Comparando los resultados de la biodegradación con EM 1 de NaCN en las tres concentraciones propuestas en el presente estudio, se puede apreciar que a las 6 horas de iniciado el ensayo, se obtuvieron mayores porcentajes de biodegradación a la concentración de 100 ppm de NaCN, apreciándose que la mayor biodegradación se obtuvo a concentración de 10 % de EM1, donde se obtuvo 19.2 % de reducción de la concentración inicial de cianuro. Al respecto Gil, E y C. Giraldo (2005) trabajando con una cepa de Pseudomona flurescens, en condiciones controladas de laboratorio, obtuvieron que a 200 rpm de velocidad y a un tiempo de duración del ensayo de 90 horas, se obtuvo un porcentaje de biodegradación de 93.94 % trabajando con CN- a concentración de 10 ppm y un porcentaje de biodegradación de 96.12 % trabajando con CN- a concentración de 15 ppm. La diferencia entre ambos trabajos se puede deber a que P. fluorescens es una cepa que proviene de los lodos de descarga de la industria del galvanizado, donde se utiliza cianuro durante la producción y las bacterias ya han estado en contacto con el compuesto a biodegradar, mientras que el consorcio de EM 1, fue inicialmente adaptado a pH 10, luego fue enfrentado por primera vez a NaCN a concentración de 100 ppm, y la prueba tuvo una duración de 6 horas, lo que puede haber disminuido la efectividad de la biodegradación del ensayo con EM1. A concentraciones mayores de NaCN, los microorganismos eficaces presentaron reducción de su efectividad, esto puede deberse a que al contar con mayor cantidad de CN- que degradar, la cantidad de producto biodegradado es menor, por lo que el porcentaje de efectividad también menor.

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La biodegradación de NaCN usando EM 1 puede deberse al cambio en el metabolismo de los microorganismos que lo componen, como lo reporta Robles, H (2010) el consorcio EM posee bacterias fotosisnteticas, actinomicetos y otros tipos de organismos. Todos éstos son entre si mutuamente compatibles y pueden coexistir en el cultivo líquido. Éstos incluyen hongos del género Penicillium, Trichoderma, y Aspergillus, y actinomycetes del género Streptomyces. Una de las condiciones que pueden haber favorecido la biodegradación de NaCN es que la investigación se desarrollo en condiciones anaerobias y tal como indica Akcil, A (2003, en Garcés et al, 2006) el proceso de biodegradación del cianuro en condiciones anaerobias se degrada principalmente en tiocianato, por lo que de haberse producido SCN- en el ensayo, este podría haber sido degradado por los hongos presentes en el consorcio, al respecto Medina, S (2012) menciona la existencia de hongos como Acremonium , Trichoderma harzianum, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Trichoderma polysporum, Scytalidiym thermophilum y Penicilium miczynski que pueden degradar productos derivados del cianuro, entre ellos los tiocianatos. Estos microorganismos han desarrollado mecanismos metabólicos para la degradación de estos compuestos utilizando enzimas como las cianasas que producen como productos finales amonio y dioxido de carbono, cianuro hidratasas que conjuntamente con las amidasas convierten el cianuro hasta formato, otros microorganismos utilizan las rodanasas, esta reacción puede ser relevante en la desintoxicación del cianuro en los organismos vivos.

Otra de las condiciones que puede haber favorecido la biodegradación de NaCN en la investigación, es que uno de los microorganismos que componen el consorcio EM se encuentran bacterias del Género Rhodopseudomonas palustres, que es una bacteria fotosintética púrpura que pertenece a las proteobacterias alfa y se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, tiene una extraordinaria versatilidad metabólica y crece por uno cualquiera de los cuatro modos de metabolismo que sostienen la vida : photoautotrophic o fotosintética ( energía de la luz y de carbono a partir de dióxido de carbono ) , photoheterotrophic ( energía de la luz y de carbono a partir de compuestos orgánicos ) , chemoheterotrophic ( carbono y de energía a partir de compuestos orgánicos ) y quimioautotrófica ( la energía a partir de compuestos inorgánicos y de carbono a partir de dióxido de carbono )

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(http://www.nature.com/nbt/journal/v22/n1/full/nbt923.html). En tal sentido es importante mencionar la investigación de Zongbai, Z et al (2014) quienes reportan una nueva cepa de Rhodopseudomonas sp PSB07-8, la misma que demostró tener la capacidad de biodegradar el acaricida Fenpropathrin hasta en un 44 % en 15 días, el ingrediente activo es alpha-cyano-3-phenoxybenzyl-2,2,3,3- tetramethylcyclopropane carboxylate, que tiene entre sus componentes a la molécula de cianuro (http://www.deepdyve.com/lp/inderscience-publishers/biodegradation-of-fenpropathrin- by-a-novel-rhodopseudomonas-sp-strain-0a02LbzoRs).

Respecto a la concentración de EM1 y su influencia en la velocidad de biodegradación de NaCN en solución, se calcularon las velocidades de biodegradación para cada una de las unidades experimentales (Tabla N° 11, 12 y 13) utilizando la cantidad de NaCN degradado y el tiempo; la velocidad de biodegradación viene a ser representada por pendiente de cada una de los gráficos.

Con estos resultados y utilizando el programa Statgraphics Versión 5.0, se analizó el análisis de varianza (ANVA) para las concentraciones de EM1, NaCN y la combinación de ambas variables independientes, para medir su influencia sobre la velocidad de biodegradación (variable respuesta) (Tabla Nº 14), en esta tabla se puede apreciar para la concentración de NaCN el valor de P es de 0.00004, este valor indica que la concentración de NaCN es significativa sobre la velocidad de biodegradación. De la misma manera al analizar la concentración de EM1 se puede apreciar que el valor de P para este valor es de 0.0023, lo cual nos indica que la variable concentración EM1 es significativa sobre la velocidad de biodegradación. Finalmente al analizar la fuente de variación concentración de NaCN en combinación con EM1, se obtiene que el valor de P es de 0.00068, lo que nos indica que ambas fuentes de variación combinadas son significativas sobre la variable dependiente velocidad de biodegradación de cianuro. Como cada uno de las variables independientes tiene tres niveles, con la prueba de ANVA, no se puede determinar cuál de los niveles es el que tiene mayor influencia sobre la variable respuesta, por lo que se realizó un análisis post ANVA, a través de la prueba de Tukey.

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El análisis del efecto de la concentración de EM 1 (gráfico N° 7) sobre la velocidad de biodegradación de NaCN, muestra que cuando la concentración de EM 1 es 5 %, la velocidad de biodegradación es 2, cuando la concentración de EM 1 es 10 %, la velocidad de biodegradación aumenta a 2.7 y cuando la concentración de EM 1 aumenta a 15 %, la velocidad de biodegradación, disminuye a 1.5.

Esta misma variación se puede apreciar cuando se realiza la prueba de Tukey a la concentración de EM 1 (Tabla Nº 15) donde se observa que la combinación de los niveles de concentración de EM 1 indica que todas las combinaciones son diferentes, excepto la combinación de los niveles 10 % con 15 % de EM 1 que reporta que son iguales. Estos resultados muestran un comportamiento fluctuante, que puede deberse a que al aumentar la concentración de EM 1 se produce también el aumento de amonio (NH3) producto de la biodegradación. El amonio presente en la solución es de más fácil asimilación por parte de los microorganismos, de tal manera que al aumentar la concentración de EM1 por encima del 10 % la velocidad de biodegradación disminuye, debido a que el NH3 es consumido antes que el NaCN. Este comportamiento coincide con lo afirmado por Hernández, L. (2010), quien menciona que la concentración de microorganismos fluctúa durante el tiempo en el que transcurre el ensayo y estas fluctuaciones tienen una relación directa con la biotransformación del cianuro y con la concentración de amonio en el medio, su investigación reporta que trabajando con Pseudomonas sp. Se parte de una concentración alta de NaCN, 1200 ppm y la concentración del amonio en el medio es nula, pero esta aumenta a medida que el NaCN es removido, aproximadamente para el día cinco la biodegradación del NaCN tiende a estabilizarse, pero ocurre un aumento en la concentración de amonio en el medio, y luego desciende nuevamente, al parecer, cuando la concentración de amonio aumenta, el microorganismo lo toma como fuente de nitrógeno dejando la toma del NaCN para cuando la concentración de amonio vuelva a descender.

El análisis del efecto de la concentración NaCN en la velocidad de biodegradación de cianuro en solución, se puede apreciar en el gráfico Nº 8, que muestra que cuando la concentración de NaCN es 100 ppm, la velocidad de biodegradación tiene un valor de 3 y cuando la concentración de NaCN aumenta a 200 ppm, la velocidad de

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biodegradación disminuye a 1.5; cuando la concentración de NaCN aumenta a 300 ppm, la velocidad de biodegradación se mantiene en el valor de 1.5. Estas mismas variaciones se puede apreciar cuando se realiza la prueba de Tukey a la concentración de NaCN (Tabla Nº 16) donde se observa que la combinación de los niveles de concentración de NaCN indica que todas las combinaciones son iguales, excepto la combinación de los niveles 200 ppm. con 300 ppm. de NaCN donde se reporta que son diferentes, por tener un valor de Tukey de 0.99.

Estos resultados se pueden explicar debido a que como los EM 1 fueron adaptados para un pH alcalino de 10.5 (Tabla Nº 33), que es un valor diferente al de su formulación inicial, al que tuvieron que enfrentarse los microorganismos, por esa razón es que al aumentar la concentración de NaCN en la solución, los EM 1 pudieron ser saturados fisiológicamente, disminuyendo la velocidad de biodegradación. Además no se puede afirmar categóricamente que al aumentar la concentración de NaCN, la velocidad de biodegradación haya disminuido, pues el análisis de la varianza de los valores de la velocidad de degradación muestra resultados que no siguen un patrón establecido (Tabla Nº 17), por lo que el método utilizado para la detección de CN- degradado debe replantearse. Esto coincide con los afirmado por Hernández, L. (2010) quien cuestiona la precisión del método titulométrico para concentraciones bajas de cianuro (APHA, 1998) pues observó que en tiempos posteriores a 48 horas de ensayo, cuando la concentración de cianuro inicial es de 300 ppm o menos, los resultados eran demasiado variables.

El D.S.010-2010- MINAM, aprueba los límites máximos permisibles (LMP), para la descarga de efluentes líquidos de actividades minero metalúrgicas, donde se aprueba que para nuestro país, el LMP para la descarga de CN- a cuerpos de agua, es de 1 ppm para una descarga en cualquier época del año y de 0.8 ppm, para una promedio anual. Con los resultados obtenidos en el presente ensayo, las aguas tratadas con EM 1 no