The Effect of Biosurfactant on Microbe Activity in the Co-Contamination System

Como fue mostrado anteriormente, se ha encontrado resistencia a todos los grupos químicos más utilizados como nematicidas, siendo además esta resistencia alta y en aumento. Surge por lo tanto la necesidad de desarrollar nuevas drogas antihelmínticas efectivas y que puedan ser combinadas con las actuales para reducir la aparición de resistencia. La identificación de nuevos blancos o moléculas suele ser uno de los mayores obstáculos en el desarrollo de nuevas drogas. Además, realizar screenings en los organismos hospederos suele ser muy caro, complejo e incluso puede enfrentar problemas éticos. Sin embargo, el uso del nematodo modelo C. elegans resulta beneficioso para estas aproximaciones, entre otras razones, por su simplicidad.

Por lo tanto, la propuesta se basa en 2 módulos diferentes: búsqueda de compuestos nematicidas utilizando una estrategia fenotípica y búsqueda de nuevos blancos nematicidas mediante ensayos con ARNi(ARN interferente de la expresión génica).

1.9.1 Búsqueda de drogas nematicidas

Se propone la búsqueda de moléculas nematicidas, principalmente mediante el uso de Nature Bank™ de la Griffith University y de algunas otras bibliotecas más pequeñas. Nature Bank es una biblioteca de extractos de una gran diversidad de plantas e invertebrados marinos del sudeste asiático y Oceanía. La misma comprende más de 63.000 muestras de diferentes organismos, a partir de los cuales se han generado más de 40.000 extractos y 200.000 fracciones. Dichas fracciones son obtenidas de acuerdo a su hidrofobicidad mediante HPLC, obteniéndose 5 fracciones por cada extracto. La biblioteca se encuentra además enriquecida en compuestos que pueden ser potenciales fármacos, siguiendo las recomendaciones de la regla de cinco de Lipinski136.

Para el análisis de una gran biblioteca de compuestos como ésta es necesaria una aproximación automatizada de tipo High-Throughput Screening. Se propone una prueba de concepto de una metodología de este tipo utilizando 10.240 fracciones de las presentes en la librería completa por duplicado en un ensayo de alto rendimiento utilizando el organismo entero (C. elegans). Para dicho cribado se propone el uso del equipo Wmicrotracker™, el cual es un equipo capaz de medir de una forma rápida, sencilla y reproducible el movimiento de C. elegans en placas de microtitulación137. Es importante recordar que los compuestos antihelmínticos afectan la locomoción de los gusanos, en algunos casos de forma directa inhibiendo canales iónicos. Asimismo, es importante recordar que los nematicidas conocidos también tienen efecto letal sobre C. elegans y de hecho los mecanismos de acción de algunos de ellos han sido dilucidados utilizando C. elegans como modelo86,138.

Se propone un “pipeline” general (Fig. 5), en el que luego de identificados extractos con actividad nematicida se procede a realizar estudios de dosis respuesta para analizar su potencia. Posteriormente se evalua su actividad nematicida frente a un nemátodo parásito como H. contortus y se determina la acción de dicho compuesto ante larvas de zebrafish para evaluar su inocuidad/toxicidad frente a vertebrados. El pipeline general, pero que escapa a los objetivos de este trabajo, incluiría además pruebas de toxicidad en ratones y estudios a campo para completar el proceso de descubrimiento de drogas nematicidas.

Figura 5: “Pipeline” general propuesto para el descubrimiento de drogas nematicidas.

Ensayo de

motilidad en C.

elegans

Estudios de dosis

respuesta

Testeo de

compuestos activos

en parásitos

Pruebas de

toxicidad en

Zebrafish

Pruebas de

toxicidad en

ratones

Estudios a campo

1.9.2 Búsqueda de blancos nematicidas

El segundo módulo consiste en el uso de ensayos comportamentales de tipo “burrowing” en el nematodo de vida libre C. elegans. Estos ensayos evalúan la capacidad de los gusanos de excavar y atravesar geles de agar al estar expuestos a diversas drogas o condiciones. La clave de los ensayos radica en la simulación de las barreras biológicas (matriz extracelular, membranas, tejidos) que los gusanos parásitos tienen que atravesar en los organismos que infectan. Si los gusanos tienen estas facultades alteradas, no serán capaces de completar su ciclo de vida. El ensayo de excavación de agar no supone superar una barrera biológica estrictamente, pero si requiere de un gusano capaz de atravesar una barrera física, y vigor neuromuscular también necesario para atravesar las barreras biológicas encontradas por los nematodos. Si los gusanos tienen estas facultades alteradas, no serán capaces de completar su ciclo de vida.

Se propone la identificación de genes específicos de nematodos responsables de este comportamiento, ya que las proteínas codificadas por éstos representan blancos farmacológicos clave para el ciclo de vida de estos organismos. Para esto se lleva a cabo un cribado con C. elegans de una biblioteca de ARNi (ARN interferente de la expresión génica) de todos los genes que C. elegans tiene en común con nematodos parásitos, pero no con vertebrados, de forma de obtener blancos altamente selectivos. En total este screening implica evaluar en microplacas la interferencia de aproximadamente 800 genes en el comportamiento de “burrowing”. El Dr. Vidal Gadea, responsable del Molecular Neuroethology Lab de la Illinois State University ha diseñado y puesto a punto estos ensayos comportamentales en C. elegans pero aplicados al estudio de la distrofia muscular. Los mismos serían adaptables para el descubrimiento de blancos farmacológicos específicos de nematodos.

2.OBJETIVOS

2.1 Objetivo General

El objetivo general de este trabajo es la búsqueda y descubrimiento de drogas y blancos nematicidas utilizando el organismo modelo C. elegans.