Engaging in debate This, the other of the two most frequent ways in which

La determinación de proteína soluble, se hizo para observar la secreción de proteínas o enzimas con respecto a la fuente de carbono y entre las fermentaciones con glucosa, comparar si el fosfato tuvo un efecto significativo en este parámetro, pero también para relacionar la formación de biomasa con proteínas de síntesis de pared celular.

Considerando la fuente de carbono, con quitina se observó una mayor concentración de proteína soluble.

9.2.2.1. Fermentación con glucosa y fosfato

En el perfil presentado en la fermentación con una fuente de carbono de glucosa y fosfato (Fig. 16, línea azul), se notó que la concentración de proteínas solubles no fue detectada desde el inicio de la fermentación, sino que se incrementó gradualmente. Este incremento gradual se revelo en tres regiones en esta gráfica, que se describen a continuación. En la primera región de las 0-48h, la tasa con la que se incrementó la concentración de proteínas fue relativamente baja (7x10-6

mgproteina/L*h), esto debido a que el hongo estaba estresado empezando a expresar

genes para la síntesis de proteínas globulares como enzimas para la síntesis de la pared celular (quitin-sintasas). Mensajeros químicos como derivados del ergosterol (ver Tabla 5) y moléculas asociadas como aminoácidos (triptófano o transportadores de moléculas), todos ellos pudieron estar en cantidades muy pequeñas en comparación a las proteínas, pero interactuar con el reactivo de Bradford, afectando la detección (Bradford, 1976).

En la segunda región de las 48-72h, la tasa de variación de la concentración de proteínas llegó a un valor máximo (4x10-5 _mg

proteina/L*h), ya que se dio,

primeramente, la secreción paralela de quitin-sintasas y endoquitinasas encargadas de la degradación de la quitina. Por otra parte, se observó un cambio de color a las 72h, como consecuencia no tanto de que los alcaloides indólicos producidos incrementaron su concentración, sino que se formaron otro tipo de alcaloides (Ver Anexo F) como resultado de las enzimas encargadas en la síntesis de psilocibina, las cuales también pudieron ser detectadas por esta técnica.

78 Por lo anterior, la concentración de proteínas a las 72h fue elevada. En la tercera región de las 72-216h, la concentración proteica aumenta ligeramente y alcanza su valor máximo (0.0017 mgproteina/mL) a las 216h, lo que se vio reflejado

en una ligera disminución en la tasa de variación de tal concentración (2x10-6

mgproteina/L*h), esto se debió a que una vez que llegó a una elevada concentración

de proteínas (principalmente enzimas) en el medio de fermentación, probablemente se reguló la producción y secreción de la mismas, produciéndose glucosamina intracelularmente como consecuencia del consumo de glucosa (figura 19) y formación continua de biomasa (figura 15), por tanto, las proteínas asociadas a esta región sirvieron más para el mantenimiento del hongo que para síntesis de quitinasas. A pesar de que el hongo estaba estresado por la baja tasa de transferencia de oxígeno al medio (Ver Anexo E), el hongo se adaptó rápidamente a la fuente de carbono de glucosa, manteniendo relativamente estable (de las 72h- 216h) la producción de proteínas para su crecimiento como las quitin-sintasas, empleadas en la síntesis y reparación de la pared celular.

9.2.2.2. Fermentación con glucosa sin fosfato

En el perfil mostrado en la fermentación con una fuente de carbono de glucosa, pero sin fosfato (Fig. 16, línea amarilla), se observó, un retraso en la producción de proteínas hasta las 72h (valores nulos desde el inicio). Comparando con el perfil de producción de biomasa, se observa un ligero incremento en este parámetro, pero no se asocia a la secreción de proteínas, por lo que se considera que las quitin-sintasas se mantuvieron en el interior del micelio.

Posterior a este tiempo, la producción es de tipo Gaussiana o parabólica, por lo que la concentración de proteínas se incrementa a una tasa de 7x10-6

mgproteina/L*h, alcanzando su máximo (0.00032 mgproteina/mL) hasta las 120h y

después disminuye (con la misma tasa, pero con signo contrario) a valores cercanos a cero. Esto se debió a que se empezaron a producir proteínas gradualmente (ver la sección de enzimas), aunque por la falta de fosfato en el medio de fermentación, el hongo no pudo establecer homeostasia, no se pudo mantener la tasa producción de proteínas y el decaimiento se prolongó hasta el final de la fermentación (216h).

79 El máximo valor obtenido en esta fermentación en comparación al valor detectado para la fermentación con glucosa y fosfato en el mismo tiempo, fue 4.875 veces menor. Esto se atribuyó a la falta de este ión, necesario para la síntesis de ciertas moléculas dependientes de fosfato como el gliceraldehído-3-fosfato, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) o el piridoxal-fosfato, implicados en la glucólisis.

Como consecuencia, el hongo no logró adaptarse a la ausencia del fosfato, aunque contaba con una fuente de carbono suficiente. La máxima concentración de proteínas en este tipo de fermentación, fue 6 y 8 veces más baja en comparación con los valores máximos obtenidos en las fermentaciones con glucosa y con quitina respectivamente.

9.2.2.3. Fermentación con quitina

En el perfil mostrado en la fermentación con una fuente de carbono de quitina (Fig. 16, línea roja), se detectaron cuatro regiones que se describen a continuación.

En la primera región de las 0-48h, es notorio que la concentración de proteínas se mantiene en 0.001 mgproteina/mL, a diferencia de las fermentaciones con

glucosa en donde la concentración inicial de proteínas es cero. Esto se debió a que el hongo activó un mecanismo de reconocimiento del substrato quitinoso, empezando a secretar proteínas como quitolectinas, como corroboran las de Xu y col. (2011) y de Liu y col. (2006) con diversas especies de hongos macroscópicos. Estos nos indicaría que se secretaron al medio otras proteínas para hidrolizar el sustrato (endo y exoquitinasas), entre otras proteínas y biomoléculas que pudieron secretarse fueron glicoproteínas, exopolisacáridos ligados a las proteínas, las cuales fueron necesarias para el mantenimiento del hongo y poder desarrollar la pared celular (Smits y col., 2001).

80 Posteriormente, de las 48h a las 72h (segunda región) se observa un descenso de la concentración de proteína soluble a una velocidad de -1x10-5

mgproteína/L*h, que puede atribuirse a que la síntesis de quitolectinas ya no era

necesaria y se dio paso a la síntesis de enzimas como endoquitinasas y quitin- sintasas. Lo anterior se corrobora, porque en la tercera región (72-120h), la velocidad con la que se incrementó la concentración de proteínas solubles fue máxima y cuantificada en 3x10-5 _mg

proteína/mL*h.

Una vez alcanzado el máximo, la concentración de proteínas solubles disminuyó a una tasa de -1x10-5 _mg

proteina/mL*h en la cuarta región (120-216h),

asociándose esto a la disminución de la producción de biomasa. Se ha estudiado la relación de la producción de biomasa con respecto a la producción de proteínas, en varios hongos de importancia comercial (Falanghe, 1962).

Figura 17. Proteína soluble de la cepa DMRN1. Los valores mostrados representan el promedio de dos repeticiones (Promedio±SD).

0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Pr od u cci ón d e Pr ot ein as (m g/m L) Horas (hr)

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