Cross-questioning:
5) Extracting definitions There are three cases where the Buddha, when asked
El perfil mostró en la fermentación con una fuente de carbono de quitina (Fig. 15, línea roja), la ausencia de una fase lag, debido a que tuvo una mayor habilidad para adaptarse rápidamente en el medio de fermentación. El gráfico presento siete regiones que se describen a continuación. El perfil evidencio como aumento la producción de biomasa a las 0-48h con una velocidad de producción de 0.0683 g/L*h, esto atribuible a que desde el inicio de la fermentación el inóculo empezó a estresarte, empezando a mostrar un crecimiento rápido. Para la segunda región (48-72h), empezó a disminuir ligeramente la producción de biomasa, a una velocidad de 0.0333 g/L*h, debido a que no tenía suficientes nutrientes para mantener su crecimiento.
Se mostró cinco regiones que se describen en esta grafica a continuación, empezando a aumentar la velocidad de hidrolisis para la producción de azucares reductores a las 0-48h (-0.00089 mg/mL*h), donde se evidencio la primera región, esto probablemente ocurrió porque se empezaron a sintetizar quitinasas las cuales degradaron la quitina presente en el medio de fermentación, produciendo
72 oligosacaridos los cuales se cuantificaron como azucares reductores, aumentando la velocidad de hidrolisis para la producción de azucares reductores en la segunda región a las 48-72h (-0.0011 mg/mL*h), probablemente la concentración de quitinasas llego a un límite liberando oligosacaridos los cuales se cuantificaron como azucares reductores.
A partir de este punto, en la tercera región (72-120h), se mantuvo constante la velocidad de producción de biomasa en un valor de 0.059 g/L*h. En esta fase de formación de biomasa a una velocidad constante, hubo secreción de proteínas, entre las que se encontraban las glicosil hidrolasas como las quitinasas (endo y exo) y quitin sintasas las cuales suelen asociarse a la síntesis y reparación de la pared celular del hongo, respaldado esto por la concentración de proteínas solubles (Fig. 16), al igual que en la fermentación con glucosa (Smits y col. 2001).
Aumento la velocidad de consumo de azucares reductores en la tercera región a las 72-120h (0.0015 mg/mL*h), esto probablemente ocurrió porque se empezó a sintetizar la pared de los hongos a partir de los oligosacaridos obtenidos de la hidrolisis de la quitina presentes en el medio de fermentación.
Posteriormente en la cuarta región (120-168h), se incrementó la velocidad de producción de biomasa al mayor valor, cuantificado en 0.16625 g/L*h, debido a que el hongo se lisó liberando exoquitinasas que degradaron la quitina del medio de fermentación y obtuvo energía para producir biomasa para crecimiento miceliar.
Aunque vuelve a aumentar la velocidad de hidrolisis para la producción de azucares reductores en la cuarta región a las 120-168h (-0.00069 mg/mL*h), esto probablemente ocurrió porque se siguieron produciendo oligosacaridos y N-acetil- glucosamina de la quitina presente en el medio de fermentación,
En la quinta región (168-216h) aunque se analizó un ligero aumento de la velocidad de producción de biomasa respecto a la región anterior (0.0108 g/L*h), en términos de concentraciones de biomasa se puede decir que esta es una etapa relativamente constante, en la que las enzimas y proteínas detectadas, fueron necesarias para el mantenimiento de las células, pero no para regeneración de pared celular o formación de hifas.
73 Aumentando ligeramente la velocidad de consumo de los oligosacaridos y el NAG obtenido de la hidrolisis de la quitina en la quinta región a las 168-216h (0.000375 mg/mL*h) para la síntesis de la pared de quitina y el crecimiento y desarrollo de los hongos.
En estas últimas dos regiones se considera que hubo fuertes limitaciones en la fermentación, para poder asimilar la quitina, lo cual se constata por el hecho de que las quitinasas se mantuvieron en valores mínimos y la concentración de proteínas en el medio descendió drásticamente, sobre todo en este último periodo. Esta concentración de biomasa es comparable a la obtenida por los hongos macroscópicos Pleurotus ostreatus (16.62 g/L de biomasa), en medio líquido con peptona, como fuente de nitrógeno y glucosa como fuente de carbono (Rodríguez y col. 2016) y Grifolla frondosa (19.21 g/L de biomasa), en sacarosa y peptona (Zapata y col. 2007). Cabe mencionar que esta fermentación fue la única que presentó fase exponencial, de las 72h hasta las 144h (Smits y col., 2001), por lo que a continuación se muestra el modelamiento matemático realizado.
En el perfil presentado en la fermentación con una fuente de carbono de quitina (Fig. 19, línea roja), se percibió una cantidad basal de 0.08 mg/mL de NAG al inicio de la fermentación, lo que se atribuye a la acción de las exoquitinasas que también fueron detectadas en cantidades mínimas, como resultado de su capacidad de generarse constitutivamente para romper la pared celular, pero también para hidrolizar algunos residuos producto de la reacción de las endoquitinasas. Cabe mencionar que se monitoreo la hidrolisis de la quitina, aunque esta técnica de detección no es específica, otros azúcares reductores como glucosa, glucosamina, quitobiosa, quitotriosa, y otros oligosacáridos de mayor grado de polimerización pudieron ser detectados.
Esto se debió a que empezó a ocupar sus reservas de energía para crecer y desarrollarse. Comparando con los perfiles de endoquitinasas y exoquitinasas se observa cómo se mantuvo una producción al inicio de la fermentación observándose una correspondencia entre la producción de endoquitinasas y exoquitinasas y los azucares reductores producidos los cuales se forman monómeros de NAG los cuales se sintetizan para la formación de la pared celular del hongo. Se ha estudiado
74 los oligosacaridos producidos por la degradación de la quitina usando quitinasas de Lecanicillum fungicola (Ramírez y col., 2006).
Los rendimientos obtenidos en la fermentación con glucosa son mostrados en la tabla 7, obtenidos de las fórmulas presentadas en el marco teórico
Los rendimientos obtenidos en los diferentes periodos mostrados en la tabla 9, muestran altos valores, aunque estos valores son el resultado de la división, se nota que el rendimiento de biomasa/sustrato el consumo de sustrato en este caso es mayor con respecto a la producción de biomasa. Esto se observa en la figura 16 de la cinética de crecimiento y tasa de consumo de sustrato, en este caso el sustrato fue quitina, aunque se consumió lentamente, se mostró un mantenimiento, esto nos indicaría que se consumió el sustrato obtenido de la lisis de la pared de quitina del hongo, manteniendo una síntesis y degradación mantenida.
Tabla 9. Parámetros cinéticos para la fermentación con quitina con
el aislado DMRN1
PERIODOS Biomasa/ Sustrato 𝒀𝑿 𝑺 TASA VOLUMÉTRICA DE PRODUCCIÓN DE BIOMASA 𝒓𝒙 TASA ESPECÍFICA DE CONSUMO DE SUSTRATO 𝒒𝑺 TASA VOLUMÉTRICA DE CONSUMO DE SUSTRATO 𝒓𝒔 COEFICIENTE DE MANTENIMIENTO 𝒎𝒔 Valor [𝒈𝒃𝒊𝒐𝒎𝒂𝒔𝒂 𝒈𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂] Valor [𝒈𝒃𝒊𝒐𝒎𝒂𝒔𝒂 𝑳∗𝒉 ] Valor [𝑳−𝟏] Valor [ 𝒈 𝑳 ∗ 𝒉] Valor [𝒈𝒈𝒍𝒖 𝒄𝒐𝒏𝒔. 𝒈𝑩𝒊𝒐𝒎∗ 𝒉 ] 𝑷𝒆𝒓𝒊𝒐𝒅𝒐(𝟎−𝟒𝟖𝒉) -42.85 0.038 -0.011 -0.00089 1.52E20 𝑷𝒆𝒓𝒊𝒐𝒅𝒐(𝟒𝟖−𝟕𝟐𝒉) -6.81 0 1.96E-5 -0.0011 3.40E-20 𝑷𝒆𝒓𝒊𝒐𝒅𝒐(𝟕𝟐−𝟏𝟐𝟎𝒉) 37.36 0.058 0.0017 0.0015 2.25E-19 𝑷𝒆𝒓𝒊𝒐𝒅𝒐(𝟏𝟐𝟎−𝟏𝟔𝟎𝒉) -68.88 0.064 5.80E-5 -0.00069 -1.819E-20 𝑷𝒆𝒓𝒊𝒐𝒅𝒐(𝟏𝟔𝟎−𝟐𝟏𝟔𝒉) -22.5 -0.042 6.20E-6 0.000375 0 𝑮𝒍𝒐𝒃𝒂𝒍(𝟎−𝟐𝟏𝟔𝒉) 0.57 0.026 -7.82E-6 0.00060 -0.2175
Figura 16. Cinética de crecimiento del aislado DMRN1 por efecto de la fuente de carbono de quitina y de fosfato. Los valores mostrados representan el promedio de dos repeticiones
(Promedio±SD).