El tratamiento de muestra es frecuentemente la etapa más larga, laboriosa y crítica para la detección y cuantificación de elementos metálicos a nivel de trazas. Estos procesos deben ser reproducibles y eficaces, lo que requiere evitar errores por pérdidas de muestra, y contaminaciones procedentes de los reactivos y materiales empleados. Las matrices en las que se han de determinar estos analitos pueden tener características muy diferentes, por lo que en un primer lugar es necesario establecer los modos de muestreo y conservación más adecuados para posteriormente aplicar la metodología analítica requerida.
Existen distintos factores que pueden ocasionar pérdidas, contaminación o transformación de las especies durante los procesos de toma y almacenamiento de las muestras. Durante el almacenamiento de la muestra se pueden alterar la concentración y la forma original del analito como consecuencia de interacciones químicas entre especies o con el material del recipiente, la acción microbiana, la temperatura, el pH, la luz,…,162 por lo que en muchos casos lo más probable es que sea necesario añadir agentes conservantes para prevenir la degradación de las especies antes del análisis. La Figura 4 ilustra las diferentes etapas llevadas a cabo en un estudio de especiación
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Figura 4. Esquema de trabajo propuesto a la hora de llevar a cabo análisis de especiación de Se en muestras
biológicas
Determinación del Contenido de Selenio
Para llevar a cabo la determinación del contenido total de un elemento traza en muestras biológicas se requiere, por lo general, la destrucción de la materia orgánica. Generalmente, el análisis de muestras biológicas y de tipo medioambiental se lleva a cabo mediante procesos de
digestión por vía húmeda. En este tipo de mineralización es frecuente la adición de uno o más
reactivos, generalmente ácidos, con propiedades complementarias (ácido-base, redox y/o
Muestreo y Almacenamiento
Tratamiento analítico de la Muestra
Detección Elemental
Técnica de Separación + Detección Elemental
(recipiente, condiciones experimentales…)
a) DIGESTIÓN (mineralización por via húmeda)
b) EXTRACCIÓN (energía de ultrasonidos)
*EXTRACCIÓN
(energía de ultrasonidos, incubaciones a temperatura controlada)
HIDROLÍSIS BÁSICAS, ÁCIDAS, ENZIMÁTICAS
* PROBLEMAS:
Estabilidad de especies (alteración e interconversión) Materiales de referencia certificados y patrones comerciales Técnicas de análisis de elevada sensibilidad
LC
(intercambio iónico, par iónico, fase inversa, excluión
molecular quiral , afinidad)
ICP-MS, ICP-OES, HG- AFS, HG-AAS (temperatura, luz, pH, liofilización…)
Objetivo:
IDENTIFICACIÓN y CUANTIFICACIÓN de ESPECIES Objetivo:
DETERMINACIÓN
de la CONCENTRACIÓN de ANALITO
(HG-AAS, HG-AFS, ICP-OES, ICP-MS)
GC
(en el caso de especies no volátiles es necesario etapa de
derivatización previa)
CE
ICP-MS, AFS, FPD, FID, AED
ICP-MS
-NO CROMATOGRÁFICAS- -CROMATOGRÁFICAS-
50 complejantes). La digestión se puede llevar a cabo en placa calefactora o en horno (200- 300ºC), bien en recipientes cerrados o abiertos. En los recipientes cerrados se alcanzan no sólo altas temperaturas sino también elevadas presiones que contribuyen a la destrucción de la materia orgánica. La digestión en recipientes abiertos sólo es adecuada cuando el analito a determinar no forma especies volátiles.Por ello, para la determinación de compuestos volátiles de Se se recomienda realizar la mineralización por vía húmeda en recipientes cerrados. En los últimos años, se ha extendido el empleo de hornos microondas por las mejoras que suponen en cuanto a la reducción del tiempo de mineralización, la cantidad de reactivos, eficacia y reproducibilidad. La digestión puede llevarse a cabo con HNO3,163 HNO3/H2O2,164 HNO3/H2SO4/H2O2 o con mezclas de HNO3 con otros ácidos.165
Aparte de la energía asistida por los hornos microondas, la energía de ultrasonidos se ha empleado con bastante frecuencia para las digestiones. Los dispositivos más utilizados son el baño y la sonda de ultrasonidos focalizada (se introduce directamente en el vial que contiene la solución de la muestra). Con esta última se alcanzan altas temperaturas, por lo que a veces es necesaria la aplicación de pulsos para evitar un elevado calentamiento de la muestra. Uno de los problemas que presenta es la emisión de armónicos audibles que resultan muy molestos y el empleo de reactivos químicos que pueden atacar la punta de la sonda. El baño de ultrasonidos consta de un recipiente de acero lleno de agua en el cual la distribución de la energía acústica es indirecta y de forma no homogénea. Con la sonda de ultrasonidos se obtienen potencias incluso 100 veces superiores a las del baño, lo que supone una reducción drástica del tiempo de tratamiento de muestra.166
Extracción de Especies de Selenio
La tarea de identificar y cuantificar en una muestra las diferentes formas químicas en que se encuentra un determinado analito es extremadamente compleja, y en la actualidad constituye una de las problemáticas más comunes en investigación.
El Se en las muestras biológicas se encuentra frecuentemente como selenoamino ácidos, que pueden estar o no incorporados a proteínas. Cuando el objetivo del análisis es la identificación de estas proteínas, se debe mantener su integridad durante el tratamiento de muestra. Los tratamientos más comunes para la extracción de proteínas suelen consistir en: extracción en agua,19 mezcla de metanol y ácido clorhídrico167 o en una disolución reguladora.21 La proteólisis constituye uno de los principales problemas en la extracción de proteínas de la célula, por producirse la liberación de proteasas que normalmente están separadas en diferentes
51 compartimentos, produciendo la acidificación del medio. De esta manera, las proteínas se pueden desnaturalizar y exponer a ataques proteolíticos. Con el objetivo de prevenir este efecto, se recomienda la extracción de proteínas a temperaturas bajas (40 ºC), en las que la actividad de las proteasas es menor, mantener el pH entre 6 y 8, y añadir un cóctel inhibidor de proteasas a la disolución reguladora.21,22 Ciertas especies de Se como selenocisteína, selenometionina y selenometilselenocisteína son susceptibles a la oxidación. Debido a que el grupo selenol tiene un potencial de oxidación considerablemente menor que su análogo de azufre,25 para prevenir la oxidación de la selenocisteína se realiza la alquilación con iodoacteamida, que es un procedimiento habitual en los tratamientos de muestra de proteínas ricas en cisteína.26,168 Otra alternativa para prevenir la oxidación tanto de los residuos de selenocisteína (por la formación de enlaces Se-Se y Se-S), así como de selenometionina, es la adición de agentes reductores como ditioteritol (DTT) y β- mercaptoetanol.169,170
Entre los tratamientos de muestra más utilizados para la extracción de selenoamino ácidos se encuentran las hidrólisis ácidas o básicas, y principalmente las hidrólisis enzimáticas,
basada en la ruptura de los enlaces peptídicos utilizando enzimas. Esta última es una de las más desarrolladas debido a que en las dos primeras la degradación de las especies ocurre con facilidad.
El tratamiento enzimático se realiza en condiciones de temperatura y pH moderados, evitando así la alteración o degradación de especies.171 Las proteasas, enzimas no específicas, son las más utilizadas en este tipo de tratamiento de muestra, entre ellas la Proteinasa K, Pepsina, Subtilisina, y la Pronasa E (Proteasa tipo XIV aislada de Streptomycus griseus), siendo esta última la más utilizada. Sin embargo, aunque la degradación de las especies no es significativa, los rendimientos de extracción en algunas matrices son bajos, probablemente debido a que la enzima no es capaz de hidrolizar los enlaces del analito en la matriz. Dependiendo del tipo de matriz, en muchas ocasiones es necesaria la utilización de enzimas como lipasas (recomendadas para muestras con alto contenido lipídico), y amilasas (utilizada en la hidrólisis de glucógeno y almidón).172 La selenometilselenocisteína y γ-glutamil- selenometilselenocisteína, especies de Se presentes fundamentalmente en vegetales pertenecientes a las familias Allium y Brassicaceae,168,26 no se encuentran incorporadas a
proteínas.27 Dado que estas especies no son proteinogénicas, la extracción de las mismas es independiente de si la hidrólisis es o no enzimática.168 Para la extracción de especies de Se que pueden estar incorporadas a proteínas, la hidrólisis enzimática, es una de las más prometedoras. En la Tabla 2 se recogen varios ejemplos de tratamientos de diferentes muestras de origen biológico empleando enzimas para la extracción de especies de Se.
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Tabla 2. Ejemplos de muestras tratadas empleando la hidrólisis enzimática para la extracción de las
especies de Se presentes
Muestra Tratamiento enizimático Especies identificadas
Mostaza India, nueces de Brasil
Proteinasa K, agitación en oscuridad 20 h/37 ºC.173,30 SeMet
Champiñones
1. H2O 3h/37 ºC agitar 200 rpm.
2. pepsina 0.05M Tris-HCl a pH 2.1 20h/37 ºC agitar 200 rpm.
3. tripsina 0.1M reguladora de fosfato a pH 7.6 20h/37 ºC agitar 200 rpm.54
SeCys2 y Se(IV)
Hígado, riñón y músculo de pollo
Proteasa XIV, 0.1 M Tris-HCl disolución reguladora a pH 7.5, 2 min USP.57
SeMet y
especies no identificadas
Ajos, Mostaza India
1. 0.1 M HCl, agitación mecánica 20h/37 ºC ó 3 min USP.
2. 0.025 M acetato de amonio pH 5.6, agitación mecánica 20h/37 ºC ó 3min USP.
3. Proteasa, agitación mecánica 20h/37 ºC ó 3 min USP.168
MetSeCys, SeMet y especies no identificadas
Levadura 1. Proteasa XIV+lipasa en Tris-HCl, sonicación 2 h 2. 12h/25 ºC.174 SeMet y SeMeSeCys Levadura Ostra Harina Subtilisina 0.1M Tris-HCl, pH 7.5, 24h/37 ºC (2 veces).68 Se(IV) y SeMet SeMet y TMSe SeCys2 y SeMet
Otras enzima, como la Alcalasa, proteasa bacteriana alcalina produzida por Bacillus
licheniformis, ha sido muy utilizada para la obtención de hidrolizados proteícos de pescados.
Su elevada capacidad de hidrólisis en condiciones de pH moderadas es mucho mayor que la de enzimas neutras o ácidas.175,176
Los procedimientos enzimáticos tradicionales implican la incubación a 37 ºC durante un tiempo entre 24 y 48 horas. La aplicación de la energía de ultrasonidos focalizada, como se ha comentado en el apartado anterior, ha supuesto una reducción considerable de los tiempos de tratamiento, alcanzándose la extracción total de Se de diversas matrices biológicas en intervalos de tiempo que oscilan entre 15 segundos y 3 minutos. La ventaja de poder reducir considerablemente el tiempo de análisis va acompañada de la desventaja de que la energía de ultrasonidos es más agresiva para las muestras, lo que supone un riesgo para la transformación
53 de las especies presentes en la matriz. La sonda de ultrasonidos se ha empelado para la extracción de distintas especies de Se (Se(IV), Se(VI), SeMet, SeMeSeCys y SeCys2) en suplementos alimenticios enriquecidos con Se. Entre las ventajas que supuso el empleo de esta metodología se encuentran: el uso de pequeñas cantidades de muestra (aproximadamente 10 mg) y bajos volúmenes de extracción.177 La energía de ultrasonidos tiene numerosas aplicaciones en el campo de la química y es empleada para la extracción de los analitos de distintas matrices.28,39