Técnicas Hifenadas: Métodos Cromatográficos Acoplados a la Espectrometría de Masas
Habitualmente, la determinación de especies requiere el acoplamiento de dos técnicas: una técnica para separar las especies químicas de interés y un método de detección sensible que pueda proporcionar la detección del analito a bajos niveles de concentración. Entre los diversos sistemas de detección (HG-AAS, HG-AFS, ICP-OES, ICP-MS), actualmente la
espectrometría de masas mediante plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS, Inductively Coupled Plama Mass Spectrometry) es la más utilizada.
En el desarrollo de esta tesis doctoral se ha empleado la técnica ICP-MS debido a su versatilidad para la determinación de trazas y ultratrazas en materiales biológicos, y a su carácter multielemental. La detección mediante ICP-MS ofrece la posibilidad de realizar medidas de relaciones isotópicas en un intervalo de linearidad superior a cuatro órdenes de magnitud.178 El analizador de masas más utilizado en ICP-MS es el cuadrupolo, que actúa como filtro separando a los iones en función de su relación masa/carga.
Uno de los problemas de ICP-MS es la presencia de interferencias espectrales. Las interferencias espectrales existentes en la determinación del Se, hace que su monitorización sea a veces problemática.179,180 La mayor interferencia es la formación del dímero 80Ar2+ que solapa con la señal del isótopo más abundante de Se, 80Se. Otros isótopos menos abundantes de Se, pero que poseen menos interferencias espectrales son: 82Se, 78Se o 77Se. El isótopo 82Se es el más empleado en la determinación de Se pues a pesar de tener una abundancia relativamente baja (8,7%) es el menos afectado por interferencias espectrales.92 En la Tabla 3 se muestran las principales interferencias para cada isótopo de Se.
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Tabla 3. Interferencias para los distintos isótopos de Se en la técnica ICP-MS
Isótopo Abundancia (%) Interferencias
74 Se 0.89 37Cl2+, 40Ar34S+, 74Ge+, 38Ar36Ar+ 76 Se 9.36 40Ar36Ar+, 40Ar36S+, 76Ge+, 39K37Cl+ 77 Se 7.63 40Ar36ArH+, 40Ar37Cl+, 41K36Ar+, 42Ca, 35 Cl+ 78 Se 23.78 40Ar38Ar+, 78Kr+, 38Ar40Ca+, 64Zn14N+, 44 Ca34S+ 80 Se 49.61 40Ar2+, 79BrH+, 80Kr+, 40Ar40Ca+ 82 Se 8.73 81BrH+, 40Ar42Ca+, 82Kr+
Estas interferencias pueden ser eliminadas mediante el empleo de las celdas de colisión y de reacción, mediante la reacción y/o colisión de los iones poliatómicos interferentes y el gas apropiado, (entre los más utilizados se encuentran el H2, He y Xe). En el caso del Se, la celda de colisiones es especialmente útil ya que permite la monitorización de los isótopos más abundantes de este elemento, 80Se y 78Se.181
Como se ha comentado anteriormente, en los análisis de especiación es necesaria una técnica que permita la separación de las especies. Esta separación generalmente se realiza empleando técnicas cromatográficas.
Las técnicas de separación más empleadas son la cromatografía líquida de alta eficacia
(HPLC, High Performed Liquid Chromatography), la cromatografía de gases (GC, Gas Chromatography), y la electroforesis capilar (CE, Capilar Electrophoresis). La principal ventaja
de CE es la capacidad para la separación de distintos tipos de analitos: cationes, aniones y pequeños iones metálicos, complejos de metales con ligandos orgánicos, compuestos organometálicos y biomacromoléculas. Sin embargo, el pequeño diámetro del capilar y los bajos volúmenes de muestra limitan la obtención de bajos límites de detección.171 Así como las interfases de GC y HPLC con el ICP-MS son relativamente sencillas, el acoplamiento de CE al ICP-MS presenta algunas complicaciones.182 CE se ha utilizado en la especiación de Se como parte de las separaciones bidimensionales.171
El acoplamiento GC-ICP-MS presenta una elevada sensibilidad y es la técnica más adecuada para el análisis de especies volátiles de Se, como el DMSe.183 También se ha empleado en la identificación de especies no volátiles de Se previa derivatización, lo que implica un
55 tratamiento de muestra más tedioso.184 Debido a que muchos compuestos de Se de interés biológico son no volátiles, HPLC es la técnica más empleada. En este caso no se requiere una etapa previa de derivatización por lo que se evita la posible descomposición térmica que puede ocurrir en GC. El fácil acoplamiento de los sistemas de HPLC a ICP-MS y los bajos límites de detección que se alcanzan, convierten a esta técnica hifenada en la más adecuada en estudios de especiación de Se. Los mecanismos de separación más utilizados en HPLC son:
Cromatografía de fase inversa y de par iónico (RP, reverse phase): La adición de agentes
formadores de pares iónicos a la fase móvil extiende la aplicación de esta técnica cromatográfica, ya que permite la separación de moléculas neutras, aniónicas y catiónicas.185 El ácido trifluoroacético (TFA) y el ácido heptafluorobutírico (HFBA) son los más utilizados.186 La cromatografía de fase inversa, requiere en ocasiones el empleo de un gradiente de polaridad, pudiéndose alcanzar altas concentraciones de disolventes orgánicos, llegando hasta el 100% de metanol o acetonitrilo. El uso de concentraciones de disolventes orgánicos elevadas afecta negativamente a la estabilidad del plasma en ICP-MS y origina una disminución de la sensibilidad. La introducción de oxígeno al gas plasmógeno y el uso de conos de platino, constituyen una alternativa para utilizar fases móviles con un alto contenido de disolventes orgánicos.187
Cromatografía de intercambio iónico (AE, anion exchange): La capacidad de los grupos
cargados positivamente de la fasae estacionaria para atraer a los aniones del soluto, y de los grupos cargados negativamente de atraer a los cationes, ha dado lugar a que ambas fases estacionarias se hayan utilizado frecuentemente en la separación de especies de Se iónicas. En los intercambiadores aniónicos, los grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen a los aniones del soluto, mientras que los intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados negativamente que atraen a los cationes de soluto.188
Cromatografía de exclusión molecular (SEC, size exclusión): Es el método de separación más
utilizado para la separación de péptidos y proteínas. Se recomienda en la separación de biomoléculas de alto peso molecular, en las cuales el heteroátomo se encuentra complejado por coordinación y no por enlaces covalentes carbono-metal, como sucede en el caso de los compuestos de bajo peso molecular. La resolución de esta técnica es baja comparada con otros mecanismos de separación, aunque es muy utilizada como técnica preparativa en separaciones multidimensionales.189,190
56 El acoplamiento HPLC-ICP-MS permite la identificación de especies mediante comparación de los tiempos de retención de las especies a identificar y de los patrones disponibles. Sin embargo, la co-elución de especies y la falta de patrones comerciales, son los principales problemas asociados a una correcta identificación y confirmación de la identidad de las especies.
Técnicas Moleculares
Para obtener información estructural se requiere el uso de técnicas moleculares de ionización suave, tales como la espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-
MS, electrospray mass) y la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF, matrix assisted laser desionization/ionization time of flight). Estas técnicas permiten paliar la falta de patrones
comerciales para la identificación de especies, aunque presentan como desventaja su elevado coste económico y baja sensibilidad, lo que implica la aplicación de etapas sucesivas de preconcentración de los extractos.
La técnica de ESI-MS permite la detección de la presencia de compuestos que contienen Se de forma relativamente sencilla, basandonos en la identificación del patrón isotópico de este elemento en el espectro de masas, así como la determinación precisa del peso molecular de las especies.133 Sin embargo, para obtener información estructural de las mismas se requiere el uso de un tándem de espectrómetros de masas, en el cual se utiliza la disociación inducida por colisión (CID, collisioni-induced dissociation) para reproducir la fragmentación del ion molecular de interés. Una de las estrategias desarrolladas para la confirmación de la estructura de las especies de Se es la fragmentación del compuesto análogo de azufre. La identidad de la especie queda confirmada al obtener fragmentos que difieren en 48 unidades, que corresponde con la diferencia de masas de los isótopos 80Se y 32S.77 Una de las principales desventajas de ESI-MS con respecto a ICP-MS, es la baja sensibilidad, lo cual representa un problema para la especiación en muestras reales donde la concentración del elemento de interés se encuentra a niveles de trazas o ultratrazas. La mayoría de los análisis de especiación de Se utilizando ESI-MS han sido encaminados a la elucidación estructural de Se-péptidos resultantes de la digestión tríptica de proteínas solubles en agua en muestras de levaduras enriquecidas con Se.191 Del mismo modo, esta técnica también ha sido utilizada para la determinación de especies de Se en plantas cultivadas en medios enriquecidos con Se.192
A diferencia de ESI, MALDI presenta una elevada tolerancia a los contenidos de sales y otras interferencias. Entre sus características destacan la sencillez, robustez y sensibilidad. Estas
57 características hacen que sea una técnica atractiva para la detección de especies que no pueden ser analizadas por ESI. El acoplamiento con un detector de tiempo de vuelo (MALDI- TOF) permite la determinación precisa de la masa de los iones, basado en el tiempo que tardan en alcanzar el detector, dependiendo de la relación masa/carga (m/z). La mayoría de las aplicaciones de MALDI-TOF en la especiación de Se se limitan a la caracterización de la fracción soluble de proteínas de levaduras enriquecidas con Se.169,193,194