La variación estructural encontrada en las antocianinas se debe: a) al número y posición de los grupos hidroxilo y metoxilo en la estructura química de las antocianidinas, b) al número y posición de los carbohidratos presentes como residuos ligados a la estructura, y c) a la presencia de ácidos orgánicos (acilación) en la molécula (Kowalczyk et al., 2003).
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Paradójicamente, las antocianinas son incoloras en el intervalo de pH fisiológico de la vacuola (3.0 a 7.0) y sólo expresan color en pH menor de 3.0 o mayor a 7.0. La asociación de las antocianinas entre sí o con otros compuestos incoloros, típicamente flavonas y flavonoles, o iones metálicos como Al3+, Fe3+, Mg2+, denominados copigmentos, son los que originan el color de las antocianinas dentro de la vacuola (Teeri y Elomaa, 2003; Tanaka et al., 2008).
Flavonoide 5/7-O-glucosil transferasa (F5GT y F7GT). Además de la glucosilación del carbono 3 de las antocianidinas, ésta también ocurre en los carbonos 5, 7 ó 3’, lo cual permite ampliar la variación de colores en los órganos pigmentados de las plantas (Yu et al., 2006). En Petunia hybrida, Verbena
hybrida y Arabidopsis thaliana, existe la enzima 5-O-glucosiltrasferasa (F5GT)
que permite formar la antocianidina-3,5-O-diglucósido, la cual es más estable químicamente (Saito y Yamazaki, 2002), en comparación con las antocianinas de una sola glucosa.
Según Kukula et al. (2004) después de la adición de una molécula de glucosa en el carbono 3, es común la adición de otra segunda glucosa en el carbono 5 del anillo B de las antocianinas. Las propiedades bioquímicas de la enzima F5GT son similares entre especies y tiene un tamaño promedio de 52 kDa, un pH óptimo de 8.0 a 8.5 y su actividad específica depende del tipo de antocianina, de manera que la preferencia del sustrato presenta un orden jerárquico: peonidina-3-glu # malvidina-3-glu # cianidina-3-glu # pelargonidina-3-glu # petunidina-3-glu # delfinidina-3-glu.
Antocianina aciltransferasa (AAT, EC 2.3.1.X). La enzima AAT transfiere un grupo acilo aromático o alifático hacia los grupos hidroxilos de la glucosa que conforma las antocianinas, estableciendo un enlace éster, usando como donadores: acetil-CoA, cafeil-CoA, 4-cumaril-CoA, malonil-CoA, o Succinil-CoA. Se localizan en el citoplasma y algunas en la vacuola (Davies y Schwinn, 2006). Es así como se forman las antocianinas aciladas (Figura 2.4). Con la acilación, las antocianinas presentan mayor estabilidad estructural, incrementan su hidrosolubilidad,
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adquieren mayor protección contra las enzimas glucosidasas y permiten su transporte hacia las vacuolas (Saito y Yamazaki, 2002), también se amplia su variación estructural, dando lugar a más de 300 diferentes antocianinas (Teeri y Elomaa, 2003).
Figura 2.4. Estructura general de una molécula de antocianina acilada. Se observan dos moléculas de glucosa en los carbonos 3 y 5 más un grupo acilo unido a la glucosa del carbono 3.
Las enzimas aciltransferasas del tipo alifáticas usan como donadores a malonil- CoA, acetil-CoA, metilmalonil-CoA y succinil-CoA; las aciltransferasas del tipo aromáticas toman como donadores a p-cumaril-CoA y cafeil-CoA. En general, los donadores más aceptados por las aciltransferasas son el malonil-CoA y cafeil-CoA y no tienen preferencia por alguna antocianina, siempre y cuando todas tengan una molécula de glucosa en su estructura (antocianinas monoglucosiladas) ya que algunas aciltranferasas prefieren las antocianinas diglucosiladas (Nakayama et al., 2003). En lo particular, las aciltransferasas de Perilla frutescens funcionan adecuadamente usando como sustrato a la cianidina-3-O-glucósido. Además, este tipo de antocianinas presentan mayor actividad biológica, según los estudios biomédicos y nutricionales (Nakayama et al., 2003).
Las flores de Ipomoea tricolor contienen antocianinas poliaciladas, indicando que se forman con la participación de una variedad de enzimas aciltranferasas (Nakayama et al., 2003).
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Las enzimas AAT son monoméricas y están conformadas de 446 a 469 aminoácidos, con un tamaño aproximado de 50 kDa y un punto isoeléctrico de 4.6. El pH óptimo para su actividad catalítica oscila entre 7.0 y 8.0. Algunas aciltransferasas tienen secuencias de aminoácidos similares (conservados) en los motivos (unidades supersecundarias) 1 y 3, por lo que se agrupan en una familia denominada versátil o superfamilia BADH o VPAT (Nakayama et al., 2003). Inclusive, estas enzimas presentan especificidad por el sustrato malonil-CoA (Unno et al., 2007).
La enzima alifática conocida como Dm3MaT3 se conforma de 17 bandas tipo beta y 17 hélices tipo alfa. El sitio de unión con el sustrato se compone de tres hélices y de dos láminas dirigidas hacia un canal donde se disponen los motivos. El primer motivo está representado por His-170 (base) el cual establece contacto mediante un enlace de hidrógeno con el carbonilo tioéster del sustrato malonil-CoA. De inmediato intervienen los otros dos residuos, que son Arg-178 y Gly-386, a través de enlaces de hidrógeno con el átomo de oxígeno del carboxilo del grupo malonilo. Otra serie de aminoácidos son los que interactúan con la CoA por medio de enlaces de hidrógeno, mientras transcurre la reacción. La especificidad de las enzimas a este sustrato se explica por el arreglo espacial de los motivos de la enzima.
Después de que ocurre la unión del sustrato con los tres motivos, en un canal adyacente compuesto por varios aminoácidos (sitio activo), se introduce la antocianina receptora del grupo acilo. La catálisis ocurre con la intervención de His-170 que extrae un protón del grupo hidroxilo de la antocianina y se activa la transferencia del grupo acilo (Unno et al., 2007). En Salvia splendens esta catálisis la efectúa la aciltransferasa SsMaT1, una vez que se forma el complejo ternario malonil-CoA-enzima-antocianina. Para esto, las bases (His-167 y Asp- 390) activan el grupo nucleofílico de la molécula de antocianina, mediante una desprotonación del grupo hidroxilo en el carbono 6’’’ de la glucosa, facilitando un
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ataque nucleofílico al carbonilo de la acilo-CoA. Después de la reacción se libera CoA-SH (Nakayama et al., 2003).
Antocianina O-metiltransferasa (OMT, EC 2.1.1.6.X). Las enzimas OMT usan como donador de un grupo metilo (CH3) a la S-adenosil-L-metionina (SAM), para transferirlo a los grupos hidroxilo de las moléculas receptoras, generando S- adenosil-L-homocisteína y metil éter derivados. Los mecanismos químicos en las reacciones de transferencia de los grupos metilo son similares entre las metiltransferasas; no obstante, difieren en su preferencia por el sustrato, debido a la estereoquímica y al patrón de sustitución con grupos hidroxilo de las moléculas receptoras. De esta manera, existen metiltransferasas específicas para chalconas, flavanonas, flavonas, isoflavonas, flavonoles y antocianinas. Las enzimas específicas de flavonoides pertenecen al grupo B, y al subgrupo 3, aquéllas que actúan sobre las antocianinas y flavanas (Ibrahim et al., 1998).
El mecanismo de acción de las enzimas chalcona-metiltransferasas incluye una desprotonación del grupo hidroxilo 2’ del anillo A de la chalcona, mediante el átomo de nitrógeno de la base (His-278) seguido de un ataque del anión hidroxilo al grupo metilo de la SAM. Debido a que el azufre de la SAM se carga positivamente, la transmetilación se facilita por medio de la desprotonación (Zubieta et al., 2001).
En Petunia, mediante la metilación en los carbonos 3’ y/o 5’ de la cianidina y
delfinidina 3-O-(4 cumaril)-rutinósido-5-O-glucósido, se producen las antocianinas modificadas peonidina y malvidina, respectivamente (Yu et al., 2006). Esta clase de enzimas no requieren Mg2+ como cofactor y tienen un peso molecular de 38 a 43 kDa(Davies y Schwinn, 2006).
Dímeros de las antocianinas. Las antocianinas también se condensan con otras moléculas. Se han encontrado estructuras dímeras como epicatequina- cianidina-3,5-diglucósido en una raza de maíz de grano púrpura, originaria de Perú; en este caso, la epicatequina pertenece al grupo de los flavan-3-oles (González et al., 2006). Estudios recientes han encontrado los dímeros entre la
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catequina con las antocianinas: cianidina-3.glucósido, cianidina-3-malonil- glucósido, cianidina-3-malonil-glucósido-5-glucósido, cianidina-3,5-diglucósido, peonidina-3-glucósido y pelargonidina-3-glucósido, en las razas Arrocillo, Purépecha y Perú (quizás Cuzco morado) (González et al., 2008).