3.0 MED12 GAIN OF FUNCTION MUTATION CAUSES LEIOMYOMAS AND
3.3.5 Expression of mutant Med12 in myometrial cells using the
las plastoquinonas.
En el capítulo anterior hemos descrito que la isoforma GGPPS11 es esencial en el desarrollo vegetal y que su actividad se localiza en los plastos y también fuera de ellos. El análisis de los mutantes letales nos ha permitido concluir que la actividad GGPPS11 extraplastídica es esencial en el desarrollo embrionario mientras que en los plastos es necesaria para su correcta biogénesis y está relacionada con la biosíntesis de carotenoides y clorofilas. Sin embargo, no hemos podido averiguar si la actividad GGPPS11 está relacionada a su vez con la producción de otros isoprenoides plastídicos. Para intentar caracterizar las funciones de GGPPS11 en el plasto de una manera más completa se estudió el alelo pálido
ggpps11‐4. En este alelo la inserción del T‐DNA se localiza en la región 5’‐UTR respecto de la
secuencia de nucleótidos GGPPS11 (Figura 10A) y cuyo se analizaron los niveles de expresión de este gen en el mutante se observó una disminución del 50% con respecto a los niveles silvestres (Figura 18A). Esto indica que una menor expresión del gen codificante para la isoforma GGPPS11 podría generar una menor actividad y por tanto causar el fenotipo observado.
Las plantas homocigotas ggpps11‐4 son más pequeñas que sus hermanas acigotas silvestres (Figura 19). Este fenotipo se observó en plántulas y planta adulta crecidas bajo los fotoperiodos de día corto y día largo. Una disminución en los niveles de carotenoides y clorofilas afecta negativamente en la eficiencia fotosintética y esto se puede traducir entre otras cosas en un crecimiento más lento. Teniendo en cuenta que la falta total de actividad GGPPS11 plastídica genera un fenotipo albino (carente de carotenoides y clorofilas) (Figura 11)
y que las plantas ggpps11‐4 son pálidas podemos pensar que es la falta de estos isoprenoides en el mutante la responsable de su retraso en el crecimiento. En concordancia, cuyo se analizaron carotenoides y clorofilas en plántulas ggpps11‐4 se comprobó que efectivamente los niveles de estos isoprenoides estaban reducidos con respecto a los silvestres (Figura 20A, B).
Para determinar si la actividad GGPPS también estaba relacionada con la producción de otros isoprenoides en los plastos se identificaron y cuantificaron los niveles de tocoferoles, plastoquinona y filoquinona en el mutante. De la misma manera que para los carotenoides y las clorofilas, también se observaron diferencias en los niveles de la mayoría de los compuestos analizados en comparación con las plantas silvestres. Detectamos una reducción del 20% en los niveles de α‐tocoferol y γ‐tocoferol, del 40% en los de plastoquinol/plastoquinona y del 60% en los niveles de su derivado plastocromanol. No se detectaron sin embargo cambios en los niveles de filoquinona (Figura 20C). En conjunto, el análisis metabólico del mutante ggpps11‐4 nos permite concluir que la actividad plastídica de GGPPS11 controla la síntesis del GGPP involucrado no sólo en la producción de carotenoides sino de otros isoprenoides cloroplastídicos relacionados con la fotosíntesis como son clorofilas, tocoferoles y plastoquinonas.
La deficiencia de tocoferoles no provoca una disminución en la eficiencia fotosintética (Sattler et al., 2004). Sin embargo, la falta de plastoquinona y filoquinona afecta a la estabilidad de los fotosistemas PSI y PSII y en consecuencia a la fotosíntesis. Las plantas del mutante simple SPPS2 (carente de actividad SPPS2 necesaria en la síntesis de plastoquinonas) son más pequeñas y más sensibles a la fotoinhibición que las silvestres (Block et al., 2013). Como consecuencia de la reducción considerable en el pool de plastoquinol/plastoquinona y plastocromanol en el mutante ggpps11‐4, estas plantas podrían ser también más fotosensibles si bien esta posibilidad no se ha testado.
Las giberelinas (GAs) también derivan del GGPP plastídico y por tanto podríamos esperar una menor producción de GAs en el mutante ggpps11‐4. La deficiencia en la síntesis o señalización de estas hormonas provoca un fenotipo de plantas enanas y generalmente más oscuras (Koornneef y van der Veen, 1980). El mutante ggpps11‐4 es más pequeño pero es pálido, lo que está en contraposición con una deficiencia de estas hormonas. Además las plantas del alelo variegado ggpps11‐1, que muestran un fenotipo más fuerte en términos de tamaño y pigmentación comparadas con las del alelo ggpps11‐4, no tienen afectados otros procesos controlados por las giberelinas como la germinación, la elongación del hipocotilo y la floración (Ruppel et al., 2013). Por tanto el fenotipo de los mutantes ggpps11‐1 y ggpps11‐4 sugiere que la deficiencia de la actividad GGPPS11 no afecta significativamente la síntesis de estas hormonas. Los niveles de GAs endógenos en Arabidopsis son muy bajos y su detección mediante técnicas de química analítica es complicada. Además el análisis fenotípico de los alelos viables indica que, si hubiera diferencias, éstas serían muy pequeñas en el mutante
ggpps11‐4. Con esta premisa y para descartar un papel de la actividad GGPPS11 en el
metabolismo de GAs se midió la expresión de algunos genes de la biosíntesis y catabolismo involucrados en su homeostasis que se han descrito como marcadores del contenido hormonal (Curaba et al., 2004; Eriksson et al., 2006). Como se observa en la Figura 21 no se detectaron cambios en la expresión de estos genes en el mutante ggpps11‐4 con respecto a los niveles en
plantas silvestres, por lo que podemos concluir que la actividad GGPPS11 no está relacionada con la síntesis de GAs. Datos no publicados del laboratorio del profesor W. Gruissem muestran que los genes codificantes para el resto de isoformas plastídicas (GGPPS2, 6‐10) se coexpresan con algunos de la biosíntesis de giberelinas apuntando que alguna o todas estas isoformas podrían ser las encargadas para producir el GGPP necesario en la síntesis de estas hormonas. Otros trabajos apuntan a rutas alternativas no dependientes de GGPP sino de GPP para la síntesis de estas hormonas (van Schie et al., 2007).
En conjunto, los datos del análisis de los perfiles metabólicos indican que la actividad GGPPS11 está relacionada con la síntesis la mayoría de isoprenoides plastídicos, con excepción de la filoquinona y las GAs. De acuerdo con estos resultados, se ha descrito que GGPPS11 está fuertemente co‐expresado con los genes que codifican las enzimas PSY (que cataliza la formación de fitoeno a partir de la condensación de dos moléculas de GGPP), GGR (necesaria para la reducción del GGPP a fitil‐PP que forma la cadena isoprenoide de la clorofila, los tocoferoles y la filoquinona) y las isoformas plastídicas SPPS1 y SPPS2 (que forman la cadena de C45 de solanesil difosfato de la plastoquinona a partir de sucesivas reacciones de condensación de GGPP) (Figura 3) (Meier et al., 2011). Sin embargo estos autores han confirmado que GGPPS11 no se co‐expresa con los genes CPS y KS que codifican dos terpeno sintasas plastídicas que constituyen los dos primeros pasos de la biosíntesis de giberelinas a partir del GGPP. Otro análisis de co‐expresión génica de la biosíntesis de isoprenoides indica que la expresión de GGPPS11 (a diferencia del resto de parálogos plastídicos) se asocia con los genes que codifican las enzimas de la vía del MEP y de la síntesis específica de clorofilas, carotenoides, tocoferoles, plastoquinona y filoquinona. Sin embargo el análisis muestra que
GGPPS11 está mínimamente co‐expresado con los genes de la biosíntesis de GAs (datos no
publicados del profesor W. Gruissem).
Los estudios de co‐expresión génica no apuntan sin embargo a que GGPPS11 esté relacionada con proteínas extra‐plastídicas (Meier et al., 2011, datos no publicados del profesor W. Gruissem). La misma situación se ha descrito para la isoforma mitocondrial SPPS3 que a pesar de localizarse también en el plasto (Ducluzeau et al., 2012), está solamente relacionada a nivel de expresión génica con proteínas del metabolismo mitocondrial y la cadena respiratoria (Ducluzeau et al., 2012; Block et al., 2013). La función de SPPS3 en el plasto está aún por determinar. Por tanto podemos decir que SPPS3 y GGPPS11 podrían describirse como dos proteínas con un papel clave en la mitocondria y los plastos respectivamente, lo que concuerda con que la expresión de sus genes esté fuertemente coordinada con la de otros del metabolismo y funcionamiento mitocondrial y cloroplastídico. Pero además, participan en el funcionamiento del cloroplasto (SPPS3) y la mitocondria (GGPPS11) desarrollando quizás funciones muy específicas y confinadas lo que justificaría que a nivel de expresión génica, no estén ampliamente relacionados con el funcionamiento de estos orgánulos
Teniendo en cuenta que la actividad GGPPS11 es clave en la biosíntesis de isoprenoides plastídicos esperaríamos que fuera un punto de control importante en el flujo de la ruta. Sin embargo, un aumento de la expresión de GGPPS11 de hasta 25 veces en líneas transgénicas y un consiguiente incremento en los niveles de enzima recombinante (Figura 22), no produjo ningún aumento en los niveles de ningún metabolito analizado. Esto podría ser debido a que la sobreexpresión estuviera generando grandes cantidades de proteína GGPPS11‐GFP no activa.
Sin embargo, la complementación del fenotipo pálido del mutante ggpps11‐4 con esta construcción permite asegurar que la proteína de fusión es activa (al menos parcialmente). Planteamos entonces dos opciones. En primer lugar, que el aporte de precursores de la vía del MEP, IPP y DMAPP, no sea suficientemente elevado. Aunque la actividad GGPPS11 disponible en las líneas transgénicas sea muy alta, si no se producen suficientes precursores, no se conseguirá nunca aumentar el flujo hacia la producción de los productos finales. Se ha descrito que los puntos clave en el control del flujo a través de la vía del MEP son los catalizados por las actividades DXS, DXR y HDR, de forma que la sobreexpresión individual de los correspondientes genes en Arabidopsis conlleva un aumento en los niveles de la mayoría de isoprenoides plastídicos, entre ellos los carotenoides (Estévez et al., 2001; Botella‐Pavía et al., 2004; Carretero‐Paulet et al., 2006). Hemos cruzado la línea SG11G#11 con otra sobreexpresora de la proteína de fusión DXS‐GFP disponible en el laboratorio para testar esta hipótesis, pero aun los resultados no están disponibles aún.
Por otro lado, el cuello de botella que justificaría por qué un aumento en la actividad GGPPS no conlleva una mayor acumulación de isoprenoides plastídicos podría estar en los pasos por debajo de la síntesis de GGPP. En el caso de los carotenoides, por ejemplo, la actividad PSY es limitante para la síntesis de estos compuestos en muchos tejidos (Ruiz‐Sola y Rodríguez‐Concepción, 2012). Por tanto, un aumento en la producción de GGPP podría no traducirse en una mayor síntesis de carotenoides si no se produce un aumento coordinado de la actividad PSY. Para ensayar esta posibilidad, se generarán líneas dobles transgénicas sobreexpresoras de GGPPS11 y PSY en Arabidopsis. En cualquier caso, es importante tener en cuenta que una mayor acumulación de carotenoides puede requerir, además de una activación de la ruta biosintética, el desarrollo de estructuras de almacenamiento adecuadas. De acuerdo con esta posibilidad, la sobreexpresión de PSY permite aumentar los niveles de carotenoides en leucoplastos de raíz y de callos crecidos en la oscuridad en Arabidopsis, pero no en los cloroplastos del tejido fotosintético (Maass et al., 2009). En este caso el factor clave no parece ser la activación de la vía del MEP (la cual no se estudia en este trabajo) o la actividad PSY per se, sino un aumento en la capacidad de almacenaje de los plastos los cuales acaban diferenciándose en cromoplastos para albergar la cantidad masiva de carotenoides sintetizada en la raíz y en los callos indiferenciados.