en los plastos.
La síntesis de GGPP constituye un punto clave de ramificación en la biosíntesis de los isoprenoides plastídicos. Una vez formado, el GGPP se reparte entre las distintas ramas biosintéticas que darán lugar a una gran variedad de productos finales derivados de este intermediario (Figura 3). Hemos confirmado que la actividad plastídica de la isoforma GGPPS11 es la principal responsable de la producción del GGPP necesario para la síntesis de carotenoides, clorofilas, tocoferoles y plastoquinona. Estos isoprenoides están relacionados con la biogénesis y el correcto funcionamiento de los plastos y con la fotosíntesis. Pero aunque sus funciones estén íntimamente relacionadas, la demanda celular de cada uno de ellos no debe ser la misma y puede variar de forma diferente en función del tejido vegetal, a lo largo
del desarrollo, y según las condiciones externas de crecimiento. Para asegurar una síntesis de GGPP suficiente y dinámica que cubra la necesidad celular de estos metabolitos en todo momento, la actividad GGPPS11 y la distribución de su producto (GGPP) hacia las distintas vías metabólicas que lo utilizan debe estar finamente regulada.
A nivel transcripcional, hemos observado que en Arabidopsis, la expresión de GGPPS11 se induce levemente durante la desetiolación (Figura 18B) para hacer frente quizás a una mayor demanda de GGPP para la producción de carotenoides y clorofilas que tiene lugar en las etapas iniciales del desarrollo fotomorfogénico (Meier et al., 2011). En pimiento se ha encontrado que la expresión del gen que codifica a la única isoforma GGPPS descrita, se activa durante la maduración del fruto y también es inducible por herida (Hugueney et al., 1996). Algunas gimnospermas como la Picea abies producen una oleorresina viscosa rica en monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos, estos últimos derivados de GGPP, que constituye un mecanismo de defensa contra el ataque de herbívoros y patógenos. Se ha descrito que la expresión génica de algunas isoformas de GGPPS se induce después de un tratamiento con MeJA (que desencadena una respuesta similar a la de un estrés biótico) quizás para aumentar la producción de la oleorresina y responder así al ataque de los patógenos y los herbívoros (Schmidt y Gershenzon, 2007; Schmidt et al., 2010). Esta inducción por MeJA también se ha observado en otras especies que producen taxol (un alcaloide de origen diterpenoide derivado del GGPP) como el tejo donde una mayor tasa de transcripción de GGPPS después del tratamiento con MeJA contribuye al aumento de la síntesis de este compuesto (Hefner et al., 1998; Liao et al., 2005).
Otro modo de regulación consiste en la canalización metabólica a través de complejos multienzimáticos. De hecho, la organización de enzimas en complejos macromoleculares es una característica central del metabolismo celular. Muchas reacciones consecutivas de la biosíntesis de productos naturales se organizan en complejos que se conocen como compartimentos metabólicos o metabolones, a través de los cuales se canalizan los intermediarios metabólicos evitando que se difundan en el medio celular (Jørgensen et al., 2005). La canalización de metabolitos a través de complejos proteicos ayuda entre otras cosas a regular la competencia entre distintas rutas por un mismo metabolito y coordinar las actividades de distintas rutas que comparten enzimas o intermediarios lo que permite en definitiva un redireccionamiento eficiente del flujo metabólico. Los análisis de co‐expresión génica son también una herramienta muy usada para predecir la formación de complejos multienzimáticos en plantas (Vranová et al., 2012). En este sentido, como hemos mencionado en el punto anterior, se ha descrito que GGPPS11 está fuertemente co‐expresado con los genes que codifican las enzimas PSY, GGR y las isoformas plastídicas SPPS1 y SPPS2 (Meier et al., 2011) indicando que la síntesis de GGPP podría estar coordinada con la de fitoeno (y la carotenogénesis), fitil difosfato (y la síntesis de clorofilas, tocoferoles y filoquinona) y solanesil difosfato plastídico (para producir plastoquinona).
Se ha descrito la presencia de enzimas GGPPS en complejos multiproteicos con PSY y otras enzimas de la biosíntesis de isoprenoides en cromoplastos de tomate (Maudinas et al., 1977; Islam et al., 1977; Camara, 1993; Fraser et al., 2000). Con estas evidencias experimentales, nos planteamos investigar si GGPPS11 podía estar acomplejándose también con otras enzimas de la síntesis de isoprenoides en el cloroplasto de Arabidopsis para ayudar a
la canalización del GGPP hacia la síntesis de sus derivados isoprenoides. Para ello y en primer lugar se desarrolló un experimento de inmunoprecipitación en plantas de la línea transgénica SG11G #11 con el anticuerpo αGFP y se identificaron posteriormente todas las proteínas aisladas mediante secuenciación por LC‐MS. Esta técnica constituye quizás la estrategia más general a la hora de determinar interacciones entre proteínas. Tiene las ventajas de que el experimento se realiza con material de Arabidopsis, implica unas condiciones suaves de extracción de proteínas que respetan la identidad de los complejos multienzimáticos, y el uso de anticuerpos específicos que aseguran el aislamiento específico de la proteína objeto de estudio y sus posibles interactores, lo que en conjunto permite la identificación de interacciones in vivo. Sin embargo, esta técnica es compleja y se hace imprescindible poner a punto los protocolos de extracción, inmunoprecipitación, preparación de las muestras, separación e identificación por LC‐MS, y análisis bioinformático final para evitar perder interacciones reales y descartar el mayor número de falsos positivos, las principales desventajas de esta técnica. Además, es importante usar controles adecuados y confirmar las interacciones encontradas mediante otros métodos.
En el trabajo contenido en esta tesis se realizaron tres inmunoprecipitaciones independientes a partir de plantas transgénicas SG11G #11 y de otra línea transgénica sobreexpresora de la doble proteína reportera GUS‐GFP como control negativo. Las muestras inmunoprecipitadas se analizaron mediante dos sistemas LC‐MS distintos, LTQ y OrbiTrap. Se identificaron 187 proteínas con el sistema LTQ y 143 con el sistema OrbiTrap, pero la mayoría de las identificaciones no se pudieron reproducir a lo largo de las tres réplicas y los dos análisis y se basaron solamente en la detección de un péptido. No obstante, la detección de GGPPS11 fue robusta con ambos sistemas de análisis. Estos resultados parecen indicar que, si bien la inmunoprecipitación de GGPPS11‐GFP fue eficaz, los posibles complejos que forma son poco estables y se disociaron en algún momento del desarrollo experimental. Alternativamente, la especificidad del anticuerpo podría no ser lo suficientemente elevada (a pesar de tratarse de un suero comercial), lo que justificaría por qué el resto de identificaciones fueron tan poco reproducibles y robustas.
En general se identificaron proteínas relacionadas con el metabolismo del plasto y la fotosíntesis, entre las cuales se destacan muchas involucradas en la síntesis de clorofilas. Estos resultados están de acuerdo con que la actividad GGPPS11 es esencial en el desarrollo plastídico y en la fotosíntesis. Además se encontraron algunos candidatos citosólicos y mitocondriales que podrían corresponder a la actividad GGPPS11 extraplastídica, aunque haría falta confirmar estas interacciones por métodos alternativos para poder concluirlo. De todos los posibles candidatos, en la tesis nos centramos en dos proteínas: geranilgeranil reductasa (GGR), que cataliza la reducción del GGPP a fitil‐PP dirigiéndolo hacia la síntesis de clorofilas, tocoferoles y filoquinona (Keller et al., 1998; Tanaka et al., 1999; Zhou et al., 2013) y solanesil difosfato sintasa 2 (SPPS2), que cataliza la elongación de una molécula inicial de GGPP mediante condensaciones sucesivas de unidades de IPP hasta formar solanesil difosfato (Hirooka et al., 2003, 2005). Recientemente se ha descrito la existencia de dos isoformas plastídicas de SPPS (SPPS1 y SPPS2). SPPS2 es la más relevante en la síntesis de plastoquinonas (Block et al., 2013), lo que está en acuerdo con que se haya identificado esta isoforma (y no la SPPS1) en la inmunoprecipitación de GGPPS11.
Aunque en el experimento de inmunoprecipitación se han identificado algunas de las enzimas que transforman el GGPP en isoprenoides plastídicos como clorofilas, tocoferoles, filoquinona y plastoquinona, no se encontró interacción con PSY a pesar de que GGPPS11 es necesaria también para la síntesis de carotenoides. Además, y como se ha descrito anteriormente, existen pruebas experimentales de la existencia de complejos multiproteicos con enzimas GGPPS y PSY en otras especies (Maudinas et al., 1977; Islam et al., 1977; Camara, 1993; Fraser et al., 2000). Por tanto en este punto se decidió confirmar la interacción de GGPPS11 con GGR y SPPS2 y ensayar la interacción con PSY mediante dos técnicas diferentes pero complementarias, el doble híbrido de levadura y la complementación de la fluorescencia en células epiteliales de cebolla. El ensayo del doble híbrido permitió justificar las interacciones GGPPS11‐PSY y GGPPS11‐GGR (Figura 26) mientras que el BiFC demostró también la interacción GGPPS11‐SPPS2 (Figura 27). Por tanto hemos demostrado que la enzima GGPPS11 es capaz de interaccionar con PSY, GGR y SPPS2 en el cloroplasto de Arabidopsis. GGPPS11 y SPPS2 se han identificado mediante estudios proteómicos en el estroma (Joyard et al., 2009). PSY se localiza en plastoglóbulos asociados quizás con los tilacoides (Shumskaya et al., 2012) y la actividad GGR se localiza los tilacoides (Soll et al., 1983; Joyard et al., 2009). En concordancia con el papel de clorofilas, carotenoides, plastoquinonas, tocoferoles y filoquinona en la fotosíntesis, la producción y acumulación de estos compuestos en el cloroplasto está asociada a membranas. Las enzimas de la síntesis de carotenoides y clorofilas se distribuyen principalmente entre las membranas externa y tilacoidal (Ruiz‐Sola y Rodríguez‐ Concepción, 2012; Joyard et al., 2009). Mientras que las prenilquinonas (filoquinona y plastoquinona) y tocoferoles se producen principalmente en las membranas externas (Schultz et al., 1981; Soll et al., 1985; Joyard et al., 2009) si bien algunos pasos de la síntesis de filoquinona se han descrito en el peroxisoma (Reumann, 2013). Sin embargo, la síntesis de los precursores de todos estos compuestos junto con la de GGPP ocurre en el estroma. Todos los pasos enzimáticos de la vía del MEP (precursores del GGPP), la vía del shikimato (precursor del homogentisato que forma parte de la estructura de los tocoferoles y las plastoquinonas) y la síntesis del ácido 5‐aminoleculínico, precursor del anillo tetrapirrólico de las clorofilas, se han identificado en el estroma (Joyard et al., 2009). Por tanto y en relación a la síntesis de la cadena isoprenoide, parece que los pasos catalizados por las prenil transferasas GGPPS11 y SPPS2 son los últimos de la ruta que tendrían lugar en el estroma lo que implicaría que a continuación el GGPP y SPP se transporten de algún modo a las membranas donde se metabolicen.
Basándonos en el análisis de los mutantes ggpps11‐2 y ggpps11‐4 y en las interacciones que hemos descrito entre GGPPS11 y PSY, GGR y SPPS2 proponemos el siguiente modelo (Figura 35). La síntesis de GGPP cloroplastídico necesario para la producción de isoprenoides relacionados con la fotosíntesis estaría gobernada por la actividad GGPPS11 en el estroma. A continuación y en función de los requerimientos celulares, GGPPS11 podría asociarse con las enzimas PSY y GGR transportando el GGPP desde el estroma hasta las membranas donde se localizan y continúan los siguientes pasos en la síntesis de carotenoides, clorofilas, tocoferoles y filoquinona. De tal manera que la interacción de GGPPS11 con PSY o GGR estaría en primer lugar aportando el sustrato GGPP y en segundo lugar controlando su canalización hacia la síntesis de unos compuestos u otros en función de los requerimientos celulares. La interacción GGPPS11‐GGR podría estar formando parte de un complejo en el tilacoide (donde se localiza
GGR) integrado quizás por otras proteínas como la clorofila sintasa, que cataliza la condensación del fitil difosfato con la molécula de clorofilida, ambas identificadas en los tilacoides (Joyard et al., 2009). Por su parte, el complejo GGPPS11‐PSY podría estar asociado a plastoglóbulos (Shumskaya et al., 2012). Estas estructuras podrían a su vez asociarse con las membranas tilacoidales o las externas donde sucede la síntesis y acumulación de los carotenoides (Ruiz‐Sola y Rodríguez‐Concepción, 2012). En concreto la enzima PDS, la siguiente después de PSY, se ha localizado en los dos tipos de membranas (Mann et al., 2000; Joyard et al., 2009). Por último, proponemos que GGPPS11 interacciona con SPPS2 en el estroma evitando que el GGPP se difunda y se emplee por el contrario para sintetizar SPP. Además, ante una demanda de plastoquinona, este complejo o sólo SPPS2, podría dirigirse a las membranas externas para interaccionar con la actividad homogenisato solanesiltransferasa (HTS) que cataliza la condensación del homogenisato con la cadena isoprenoide propiciando al igual que en los casos anteriores, la canalización de SPP (y de GGPP en consecuencia) hacia la síntesis de plastoquinonas. Teniendo en cuenta que la sobreexpresión de GGPPS11 no conlleva un aumento en la síntesis de isoprenoides finales (Figura 24) y atendiendo al modelo que acabamos de proponer, postulamos que el papel de esta actividad en el flujo de isoprenoides no radica en el control del mismo sino en su redireccionamiento. Así ante una demanda determinada de isoprenoides, la actividad GGPPS11 se regularía interaccionando con unas enzimas u otras para canalizar finalmente el GGPP hacia la ruta activada.
ENZIMAS SÍNTESIS CLOROFILAS G11 GGR GGPP fitil‐PP clorofila a/b PSY GGPP fitoeno fitil‐PP ENZIMAS SÍNTESIS PRENILQUINONAS plastoquinonas filoquinona tocoferoles G11 SPS2 SPP G11 G11 PSY PG PG ENZIMAS SÍNTESIS CAROTENOIDES carotenoides G11 GGPP
Plástido
Figura 35. Canalización del GGPP
plastídico hacia la síntesis de carotenoides, clorofilas, tocoferoles, plastoquinonas y filoquinona controlada por la actividad GGPPS11. Las abreviaturas corresponden a las indicadas. Los colores indican enzimas localizadas en el estroma (naranja), en los tilacoides (verde) y en las membranas externas (de la cubierta) de los plastos (amarillo).