Dado que en los experimentos previos de inoculación con Azoarcus sp. CIB se observó un aumento de la producción de biomasa, sin que se vieran modificados otros parámetros de crecimiento del arroz, y con el objetivo de profundizar en el estudio de cómo las propiedades PGP afectan a la interacción con planta, se decidió implementar el potencial PGP de la cepa CIB mediante la introducción de alguna nueva propiedad. Una propiedad PGP ampliamente extendida en bacterias que interaccionan con plantas y que promueve el crecimiento de estas últimas es la actividad ACC desaminasa que, como se ha detallado en el apartado 2.3.1 de la Introducción, está relacionada con la reducción
Resultados
117
de los niveles de estrés mediados por etileno y que, hasta la fecha, no se ha descrito en ninguna bacteria del género Azoarcus (Mitter et al., 2013; Faoro et al., 2017).
3.1.- Clonación y expresión del gen acdS en Azoarcus sp. CIB
Para obtener una cepa de Azoarcus sp. CIB con actividad ACC desaminasa, se clonó en primer lugar el gen acdS (codifica la enzima ACC desaminasa) de B. phytofirmans PsJN en el plásmido pIZ1016, bajo control del promotor Ptac, obteniéndose el plásmido pIZacdS (Tabla 5), tal y como se detalla en el capítulo 3.7 de Materiales y Métodos. A continuación, se subclonó la fusión Ptac:acdS en el plásmido pSEVA237, generándose así el plásmido pSEVA237acdS (Tabla 5) que fue posteriormente transferido a Azoarcus sp. CIB mediante conjugación.
Figura 23. Actividad ACC desaminasa en diferentes bacterias. Se realizaron los ensayos de actividad ACC desaminasa según los protocolos detallados en el apartado 6.2.2 de Materiales y Métodos. A) Ensayo colorimétrico de actividad ACC desaminasa en la cepa silvestre Azoarcus sp. CIB (izquierda), en la bacteria con actividad ACC desaminasa B. phytofirmans PsJN (centro) y en la cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) (derecha). El revelado de la reacción progresa en intensidad desde amarillo (negativo) a marrón oscuro (positivo). B) Ensayo espectrofotométrico de la enzima ACC desaminasa durante la conversión del sustrato ACC en los productos NH4 y α-cetobutirato (nmol α-cetobutirato μg proteína total-1 h-1) en las tres cepas
estudiadas. Los valores son la media de tres experimentos independientes ± su desviación estándar.
Para confirmar que la cepa Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) poseía actividad ACC desaminasa se realizó un ensayo enzimático siguiendo el protocolo previamente descrito (Penrose y Glick, 2003) y detallado en el apartado 6.2.2 de Materiales y Métodos. Los resultados del ensayo mostraron que, efectivamente, la cepa silvestre Azoarcus sp. CIB no presenta actividad ACC desaminasa
118
mientras que la cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) posee una elevada actividad enzimática (6.716 nmol μg-1 h-1), duplicando los valores
obtenidos con B. phytofirmans PsJN (3.716 nmol μg-1 h-1) (Fig. 23). Cabe destacar
que el hecho de que la cepa recombinante posea mayor actividad ACC desaminasa que la cepa original B. phytofirmans PsJN podría ser debido a que el gen acdS se localiza en un plásmido multicopia y bajo expresión constitutiva del promotor Ptac en la cepa recombinante.
3.2.- Efecto de la inoculación de la cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) en plantas de arroz
Para determinar si la cepa Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) con actividad ACC desaminasa mostraba una mayor capacidad PGP que la cepa silvestre, se decidió inocular ambas cepas en arroz cultivado en condiciones de estrés que promuevan un incremento de la síntesis de etileno en la planta. La condición de estrés seleccionada fue el crecimiento del arroz en presencia de concentraciones subletales de cadmio, un elemento no esencial cuya acumulación en tierras contaminadas afecta de forma significativa a la producción agrícola debido al estrés severo que provoca sobre la planta. La respuesta de las plantas a metales pesados se ha asociado con la generación de ROS y con un aumento de los niveles de etileno (Keunen et al., 2016), siendo el cadmio uno de los compuestos inorgánicos con mayor efecto fitotóxico y con mayor capacidad de inducción de la síntesis de etileno (Arteca y Arteca, 2007). Por otro lado, Azoarcus sp. CIB es resistente a concentraciones relativamente altas de cadmio (1,5 mM), en contraste con las plántulas de arroz para las cuales el cadmio resultó letal a una concentración de 500 µM.
Para la consecución del experimento se germinaron semillas de arroz, tras su desinfección superficial, y se inocularon, de forma independiente, con la cepa control Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) y la cepa productora de ACC desaminasa Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) tal y como se detalla en el apartado 6.3.4 de Materiales y Métodos. A las 24 h horas de la inoculación, las plántulas se transfirieron a tubos de ensayo con medio Hoagland’s semisólido (0,4% agar) y tres concentraciones de cadmio: 0 (Control), 20 µM y 50 µM. Las plántulas se
Resultados
119
cultivaron durante dos semanas en condiciones de invernadero. Transcurrido este tiempo se recolectaron y se midió el peso fresco y la longitud de las plantas (Tabla 8).
Tabla8. Peso y longitud de plantas de arroz crecidas en medio Hoagland’s con cadmio.
Condición Peso Fresco (mg) Longitud (cm) Control
Sin inocular 393 ± 37 11,2 ± 0,37
Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) 402 ± 45 11,54 ± 1 Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) 377 ± 41 11,59 ± 0,47 Cadmio 20µM
Sin inocular 230 ± 28 7,8 ± 0,29
Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) 245 ± 19 8,74 ± 0,55 Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) 235 ± 20 9,14 ±0 ,34 Cadmio 50µM
Sin inocular 166 ± 15** 6,72 ± 0,3*
Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) 173 ± 11** 7,72 ±0 ,24 Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) 202 ± 28 8,2 ± 0,45 n= 10 plantas ± desviación estándar. Los asteriscos muestran la significancia de las diferencias observadas respecto a la cepa con actividad ACC desaminasa, al aplicar el método estadístico de análisis de varianza ANOVA y test de Bonferroni P<0,01 (**); P<0,05 (*).
Los resultados presentados en la tabla 8 muestran una tendencia al aumento del crecimiento y, más acusadamente, de la biomasa en las plantas de arroz sometidas a una condición de estrés severo (Cd 50 µM) cuando son inoculadas con la cepa recombinante Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) frente a cuando se inoculan con la cepa control o frente al control sin inocular. En la figura 24 se observa claramente el efecto pernicioso sobre el crecimiento del arroz cuando se incrementa la concentración de cadmio en el sustrato de crecimiento. Sin embargo, a la concentración más alta de cadmio testada, 50 µM, la inoculación con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) tiene un efecto promotor del crecimiento del arroz respecto a la no inoculación o a la inoculación con la cepa sin actividad ACC desaminasa.
120
Figura 24. Efecto del cadmio sobre el crecimiento de plántulas de arroz inoculadas con cepas de Azoarcus sp. CIB. El arroz se cultivó en medio Hoagland’s o medio Hoagland’s suplementado con 20 µM de Cd o 50 µM de Cd. Las plantas fueron germinadas e inoculadas según se detalla en 6.3.4 Materiales y métodos y se cultivaron durante 15 días en condiciones de invernadero. En las imágenes se muestra una planta de cada condición en el momento de su recolección.
Como se ha comentado anteriormente, la respuesta de la planta ante el estrés producido por metales pesados está muy relacionada con la formación de ROS y el aumento de los niveles de etileno (Keunen et al., 2016). Con el objetivo de conocer si la inoculación con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237) o con Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) afectaba de forma diferencial a los niveles de ROS del arroz, se midió la actividad de la enzima SOD, una enzima ligada con la respuesta al estrés oxidativo producido por el metal en la planta, en muestras de raíz siguiendo el protocolo descrito en el apartado 6.2.3 de Materiales y Métodos. Los resultados obtenidos en ausencia de inoculación bacteriana indican que, como era previsible, la actividad de la enzima superóxido dismutasa del arroz se ve incrementada en presencia de cadmio (hasta un 66% en presencia de 50 μM de Cd) (Fig. 25). Sin embargo, la respuesta de las plantas a este estrés se ve modificada al inocularlas con las cepas de Azoarcus. Así, la tendencia indica que la actividad SOD disminuye en las plantas inoculadas respecto al control sin inocular, siendo especialmente destacable esta disminución cuando se inoculan con la cepa Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS).
Resultados
121
Figura 25. Medida de la actividad de la enzima SOD en raíz de arroz. Las muestras de plantas cultivadas en medio Hoagland’s con presencia/ausencia de cadmio y bacterias se recolectaron y se valoró la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) según se indica en el apartado 6.2.3 de Materiales y Métodos. Los datos representados son la media ± desviación estándar de 10 muestras. Los asteriscos muestran la significancia al aplicar el método estadístico de análisis de varianza ANOVA y test de Bonferroni. P<0,01 (**); P<0,05 (*).
Estos resultados sugieren que la cepa Azoarcus sp. CIB (pSEVA237acdS) con actividad ACC desaminasa modula los niveles de etileno que se produce en la planta, provocando una mejora en el crecimiento del arroz en condiciones de estrés e influyendo en la respuesta defensiva de la planta que muy probablemente reduce la generación de ROS en presencia de cadmio.