A framework for access control modeling

Durante el período de estudio (julio 2012 a julio 2013), recolectamos dos muestras de heces por mes de cada uno de los individuos de todos los grupos estudiados. Para la recolección de las muestras se utilizaron técnicas no invasivas procurando que los individuos no fueran perturbados durante la recolección (Ziegler y Wittwer 2005, Martínez-Mota et al.2008, Hodges y Heistermann 2011, Cantarelli et al.2016). En todos los casos que fueron posibles recolectábamos la muestra de la primera defecación del día. Estas muestras fueron colectadas y analizadas para testear la Hipótesis de Estrés (Capítulo I, sección 1.5.3). Para este análisis se consideraron únicamente a los individuos adultos, sub-adultos y juveniles ya que son los únicos que han sido observados descansando de manera aislada (alejados de otros individuos), no así los más jóvenes (crías o infantes) quienes siempre descansan en contacto con sus madres.

Recolectábamos las muestras en bolsas plásticas, que eran rotuladas con nombre de individuo, grupo al que pertenece, fecha y hora. Inmediatamente después de la recolección colocábamos la muestra en una heladera portátil para su conservación a bajas temperaturas. Cuando regresábamos a la EBCo, colocábamos las muestras en un freezer a -20°C para mantenerlas conservadas hasta su análisis (Fig. II11).

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Fig. II11:

Fig. II11. Secuencia de colecta de muestras de heces para análisis de cortisol. a) Identificación del individuo al momento de defecar y marcado de las heces, b) colecta de las heces, c) rotulo de las muestras colectadas, d) refrigeración en heladera portátil con geles refrigerantes, e) almacenamiento de las muestras

en un frízer para ser analizadas posteriormente.

En agosto de 2014 realizamos la obtención del extracto fecal a partir de las muestras obtenidas en el campo. Esta tarea fue realizada en el laboratorio de hormonas de la EBCo, el cual fue acondicionado y equipado apropiadamente para realizar dicho procedimiento.

Para la obtención de extracto fecal primero descongelamos las muestras. Rotulamos los tubos que se iban a utilizar (Tubos de polipropileno 5 ml tapa a rosca). Luego, preparamos el metanol diluido al 80% con agua destilada (se utilizaron 5 ml por muestra fecal). Se pesó 0,5 gr de materia fecal previamente mezclada a la que se le retiraron hojas, semillas y cualquier elemento que no sea materia fecal. Se colocó en el tubo 0,5 gr de materia fecal separada previamente y 5 ml de metanol diluido, una vez colocadas ambas cosas en el tubo, se agitó manualmente. Cada uno de los tubos fue

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colocado en el Vortex durante 2 minutos. Luego, todos los tubos se colocaron en el agitador durante 2 horas. Se regulo la velocidad de manera tal que el líquido de cada tubo llegue a los extremos del mismo durante cada movimiento de agitación. Después del agitador todos los tubos fueron colocados en la centrifuga y se centrifugaron a 2000 rpm. Previamente a retirar los tubos de la centrifuga, se rotularon los tubo de Kahn de plástico que se utilizarían para colocar los extractos. Se retiraron de la centrifuga los tubos, y se extrajo el sobrenadante que fue colocado en los tubos de Kahn rotulados. Se conservaron los tubos de Kahn con el extracto fecal en el frízer hasta su envío al laboratorio donde se realizó la medición de los niveles de Metabolitos de cortisol. Obtuvimos el extracto fecal de 505 muestras (Tabla 3.9, Capítulo III).

Los extractos fueron enviados a la Cátedra de Fisiología Humana- INICSA- CONICET- Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba – Argentina, donde la Dra. Marina Ponzio y la Lic. Verónica Cantarelli realizaron el dosaje de las muestras para determinar mediante la técnica de inmunoensayo enzimático (EIA) el nivel de metabolitos de cortisol presente.

Fig. II12:

Fig. II12. Secuencia de la obtención del extracto fecal para análisis de cortisol. a) Descongelado de las muestras de heces, b) pesado de las muestras, c) dilución de las muestras, d) colocación de las muestras en el Vortex, e) colocación de las muestras en el agitador, f) centrifugación, g) extracción del sobrenadante, h)

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2.9.3.1. Procedimiento para el dosaje de los extractos

La concentración de metabolitos de cortisol presentes en los extractos fecales se determinó utilizando la técnica de inmunoensayo enzimático (EIA) con un anticuerpo policlonal y sus correspondientes conjugados de peroxidasa para la detección de cortisol (cortisol R4866, Department of Population Health and Reproduction, Coralie Munro, UC Davis, CA, USA). El anticuerpo presenta las siguientes reacciones cruzadas: prednisolona (9.9%), prednisona (6.3%), cortisona (5.0%), corticosterona (0.7%), 21-deoxycortisona (0.5%), deoxycorticosterona (0.3%), progesterona (0.2%), 11-desoxycortisol (0.2%), 17a-hydroxyprogesterona (0.2%) y <0.1 % con todos los otros esteroides testeados.

Los inmunoensayos fueron realizados de acuerdo a la técnica descripta por Munro y Lasley (1988). Para ello se utilizaron microplacas de fondo plano (Nunc Maxisorp, VWR, Mississauga, ON, Canadá) recubiertas con 50 µl de anticuerpo diluido en solución buffer de recubrimiento (50 mM de buffer bicarbonato, pH 9.6, dilución 1:12000); las placas luego fueron cubiertas con selladores de acetato para evitar la evaporación, y se incubaron durante la noche a 4°C. Luego de 16 - 24 horas, las placas fueron lavadas a fin de eliminar las moléculas de anticuerpo no unido, con una solución de Tween 20 al 0,02 % utilizando un lavador automático de microplacas (Bio-Tek Elx 50 V, Bio-Tek Instruments). Inmediatamente después del lavado, 50 µl de los extractos fecales, de los estándares y de los controles se añadieron por duplicado a la microplaca, seguido por la adición de 50 µl del conjugado de peroxidasa correspondiente a la hormona de interés (dilución 1:34400). A continuación, las placas se cubrieron e incubaron a temperatura ambiente (21°C) durante 2 horas en shaker orbital. Posteriormente, las placas se lavaron y secaron con papel secante, agregando inmediatamente 100 µl de solución sustrato (50 mM de citrato, 1,6 mM de peróxido de hidrógeno, 0,4 mM de 2,20-azino-di-(3- etilbenzotiazolin sulfónico) sal de diamonio, pH 4). Finalmente, se midió la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplacas (Thermo Electron Corporation, USA). La sensibilidad del ensayo fue de 0,078 ng/ml. Los coeficientes de variación intra- e interensayo fueron de <12 y 6,7%, respectivamente.

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