Future studies

3.2.1. Obtención de muestras de tejido adiposo.

Para llevar a cabo este estudio se han utilizado ratas Wistar adultas procedentes del Servicio de Experimentación Animal de la Universidad de Córdoba y muestras de tejido proporcionadas por la Dra. R.D. Kineman y por el Dr. R. Luque de la Universidad de Illinois en Chicago (EE.UU.), obtenidos de ratones macho adultos de la cepa C57Bl/6J y ratones ob/ob así como de ratones obesos New Zealand y los controles de éstos (Ratones NON) suministrados por Laboratorios Jackson. Además, se utilizaron muestras de tejido adiposo de ratas Sprague-Dawley proporcionadas por el Dr. Carlos Diéguez, de la Universidad de Santiago de Compostela. Los animales se mantuvieron en condiciones constantes de temperatura (22 °C), con un período luz- oscuridad de 12 h (de 7:00 a 19:00 h), y con libre acceso a comida y agua. Para la realización de los experimentos, los animales fueron sacrificados por decapitación, siguiendo la normativa recogida en la legislación nacional y europea, y aprobada por el Comité de Bioética de las respectivas Universidades involucradas en el estudio sobre manipulación y uso de animales de experimentación.

Por otra parte, se utilizaron muestras de tejido adiposo humano, tanto visceral como subcutáneo. Estas muestras se obtuvieron siguiendo la normativa recogida en la legislación nacional y europea y aprobada por el Comité Bioético del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba así como de la Clínica Universitaria de Navarra y

del Hospital Virgen de la Victoria de Málaga. En todos los casos se obtuvo el consentimiento informado del paciente.

Los tejidos destinados a dispersión celular (tejido adiposo blanco visceral y/o subcutáneo) se introdujeron en Krebs-Ringer Hepes buffer inmediatamente después de su extracción y a continuación se realizó la dispersión celular. Los tejidos destinados a la extracción de ácidos nucleicos o proteínas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

3.2.2. Dispersión de tejido adiposo y obtención de fracción de adipocitos

maduros y estroma vascular.

La separación celular del tejido adiposo blanco se realizó siguiendo el protocolo descrito por Rodbell (1964) y modificado por Cushman & Malide (2001). Para llevar a cabo los estudios, se recogieron muestras de tejido adiposo visceral y/o perigonadal así como subcutáneo sumergiéndose rápidamente en 20 ml de medio de cultivo estéril Krebs-Ringer Hepes pH 7,4 (NaCl 119 mM, KCl 4,7 mM, MgSO4 1,2 mM, CaCl2 2,5 mM,

KH2PO4 1.2 mM, Hepes 20 mM, Glucosa 2 mM y BSA 2%). Con objeto de obtener una

suspensión de células monodispersas de adipocitos y/o estroma vascular, el tejido adiposo se sometió a un proceso de dispersión enzimático-mecánico como se detalla en el protocolo 1.

3.2.3. Cultivo de la línea celular 3T3-L1.

La línea celular utilizada para realizar este trabajo es la línea celular 3T3-L1. Se trata de células de tipo fibroblástico obtenidas a partir de embrión de ratón y fueron obtenidas gracias a la generosidad del Dr. C. López Otín, de la Universidad de Oviedo. Originalmente, estas células provienen de la línea celular 3T3 (Swiss albino) sometidas a un proceso de aislamiento clonal desarrollado por Green y colaboradores (Green y Meuth, 1974), eligiendo aquellos clones capaces de diferenciarse de fibroblastos a adipocitos en presencia de un cocktail hormonal.

El cultivo de esta línea celular se realizó siguiendo las pautas indicadas por la ATCC (American Type Culture Collection), teniendo siempre en cuenta que las células

no alcancen un grado de confluencia superior al 70-80%, ya que, de lo contrario, se reduciría su capacidad de diferenciación a adipocitos. Todos los cultivos celulares se han llevado a cabo en un incubador a 37 °C con 95% de humedad y 5% de CO2. Por

último, es importante destacar que todos los experimentos sobre células 3T3-L1 incluidos en este trabajo se han llevado a cabo con células entre los pases 4-15. A partir de 15º pase, los cultivos fueron desechados y sustituidos por un nuevo vial de células mantenidas en nitrógeno líquido.

Las células 3T3-L1 fueron cultivadas en medio DMEM conteniendo 4,5 g/l glucosa y suplementado con L-glutamina 4 mM, solución antibiótica-antimicótica al 1% (v/v), 1,5 g/l bicarbonato y suero de bovino recién nacido (NCS) al 10% (v/v). Los cultivos de mantenimiento de estas células se realizaron en botellas de 75 ó 150 cm2 a una densidad inicial de 2.000 células/cm2, y fueron refrescados dos veces por semana mediante el uso de una solución comercial que contiene tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l. Las células obtenidas se sometieron a un test de viabilidad celular mediante la técnica de azul tripán y, a continuación, se sembraron en diferentes soportes según la finalidad del experimento en cuestión. Así, las células utilizadas para microscopía de fluorescencia se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diámetro que fueron colocados en placas individuales de 35 mm o en placas de 6 pocillos a una densidad de 30.000 células/cm2. Las células destinadas a la obtención de extractos de ARN o proteína se sembraron en placas individuales de 35 mm de diámetro o placas de 6 pocillos a la misma densidad que en el caso anterior y aquellas destinadas a experimentos de electroporación se cultivaron en placas de 150 mm de diámetro a una densidad de 2.700 células/cm2. En todos los casos mencionados anteriormente, las células se sometieron a un proceso de diferenciación a adipocitos. Brevemente, se dejaron crecer las células hasta alcanzar un 100% de confluencia, momento en el cual se incubaron con DMEM con glucosa (4,5 g/l) y suplementado con L-glutamina (4 mM), solución antibiótica-antimicótica al 1% (v/v), bicarbonato (1,5 g/l), suero fetal bovino al 10% (v/v), 10 μg/ml de insulina, 0,25 μM de dexametasona y 0,5 mM de IBMX (medio de diferenciación I) durante 72 h. Transcurrido este período, las células se incubaron en DMEM con glucosa (4,5 g/l) y suplementado con L-glutamina (4 mM), solución antibiótica-antimicótica al 1% (v/v), bicarbonato (1,5 g/l), suero fetal bovino

al 10% (v/v) y 10 μg/ml de insulina, manteniéndose en este medio 72 h. A partir de ese momento, se mantiene el cultivo celular con DMEM con glucosa (4,5 g/l) y suplementado con L-glutamina (4 mM), solución antibiótica-antimicótica al 1% (v/v), 1,5 g/l bicarbonato, suero fetal bovino al 10% (v/v) (medio de diferenciación II), el cual se mantuvo, renovándose cada 48 h, hasta que las células fueron utilizadas para las distintas manipulaciones experimentales.

El grado de diferenciación se comprobó mediante la observación de las células teñidas con una solución de Oil Red O (Ramirez-Zacarias et al., 1992), que se une específicamente a los triglicéridos neutros acumulados en las células (ver protocolo 2).