THE USER INTERFACE NEEDS TO BE REVAMPED IT DOES NOT MAKE YOU FEEL LIKE YOUR ACTUALLY CONFIGURING A

3.4.1. Aislamiento de ARNm.

El aislamiento del ARNm total de las muestras procedentes de la línea celular 3T3-L1 así como de las muestras de tejido adiposo visceral o subcutáneo de rata y ratón se llevó a cado utilizando el reactivo Trizol, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se añadió 1 ml de dicho reactivo a cada muestra. El procedimiento seguido se detalla en el protocolo 4.

Las muestras de tejido adiposo humano, se procesaron de manera similar, pero se incluyó un tratamiento con DNAsa I (Promega), utilizando 1U de enzima por cada μg de ARN inicial.

En todos los casos, la concentración de ARN total obtenido se determinó por espectrofotometría y su calidad se comprobó mediante la relación entre la absorbancia a 260 y 280 nm.

3.4.2. Retrotranscripción del ARN.

La retrotranscripción de ARN se realizó utilizando el kit comercial cDNA First

Strand Synthesis kit sobre una cantidad de ARN total de partida de 2 µg. La

retrotranscripción se llevó a cabo con hexanucleótidos de secuencia aleatoria (150 ng/reacción, Amersham Biosciences, Munich, Alemania) siguiendo las instrucciones del proveedor comercial.

3.4.3. Diseño de oligonucleótidos para PCR.

Para el diseño de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo se utilizó el programa Oligo 6.0 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, EE.UU.). En todos los casos, se eligieron oligonucleótidos altamente específicos para la secuencia de interés. Se evitaron oligonucleótidos que pudieran formar estructuras secundarias muy estables tanto consigo mismo como entre el par. También se evitaron los que pudieran amplificar de forma inespecífica otros genes así como los que presentaran otros sitios de unión inespecífica. Además, se seleccionaron oligonucleótidos cuya temperatura de alineamiento rondase los 60 ºC. Por último, las parejas de oligonucleótidos se

diseñaron en exones distintos para evitar la amplificación del ADN genómico que pudiera contaminar la muestra. Una vez diseñados, se verificaron las características de los oligonucleótidos con el programa Primer3 (v. 0.4.0) (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/ primer3 www.cgi; Steve Rozen, Whitehead Institute for Biomedical Research).

3.4.4. PCR cuantitativa en tiempo real.

Para el análisis cuantitativo de la expresión de Rab18 en las diferentes muestras generadas en el presente estudio, se utilizó la técnica de PCR en tiempo real (RT-PCR) empleándose un termiciclador iCycler IQ de BioRad y el reactivo fluorescente SYBR

green, capaz de emitir fluorescencia cuando se intercala en el ADN de doble cadena.

Las reacciones de PCR se realizaron por duplicado en un volumen final de 25 µl conteniendo 100 ng de ADNc como molde, 10 nM de cada oligonucleótido cebador y 12,5 µl de IQ SYBR Green supermix 2x (Bio-Rad). Se utilizaron las parejas de oligonucleótidos para Rab18 detalladas en la Tabla 3 y los cebadores para amplificar el ARN ribosómico 18S como gen estándar interno, elegido entre varios genes (HPRT, ciclofilina y 18S) como el estándar interno más estable en nuestras muestras (Tabla 3).

Nombre # acceso GenbanK Secuencia Tamaño esperado Tª anneling 5’ -CTCTGAAGATACTCATCATCGG- 3’ Ratón Rab18 NM_181070 5’ -CCTCTCTTGACCAGCTGTATCCCA- 3’ 185 pb 60 ºC 5’ -CTCTGAAGATCCTCATCATTGG- 3’ Rata Rab18 NM_001012468 5’- CTTTCTTGACCAGCTGTATCCCA- 3’ 185 pb 60 ºC 5´- CCCTGAAGATCCTCATCATCGG- 3´ Humano Rab18 NM_021252 5´ -CCTCTCTTGACCAGCAGTATCCCA- 3´ 185 pb 60 ºC 5’ -CCCATTCGAACGTCTGCCCTAT- 3’ Ratón/ Rata/ Humano 18S NM_008907 5´ -TGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTA- 3’ 137 pb 60 ºC 5´-TGGTCTTTGGGAAGGTGAAAG-3´ Ratón Ciclophilin A NM_008907 5´-TGTCCACAGTCGGAAATGGT- 3´ 109 pb 60 ºC 5’ -CAGTCCCAGCGTCGTGATTA- 3’ Rata HPRT NM_012583 5’ -CTCTGAAGATCCTCATCATTGG- 3’ 139 pb 60 ºC

Tabla 3. Secuencia, codigo de acceso, tamaño del producto de amplificacion y temperatura óptima de alineamiento de los oligonucleotidos utilizados en la amplificación específica de los genes analizados en este estudio mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

La amplificación de los diferentes genes se llevó a cabo siguiendo un programa que consistió en un primer paso de desnaturalización a 94 ºC durante 2 min seguido por 40 ciclos de amplificación formados por un paso de desnaturalización a 94 ºC durante 15 seg, alineamiento a 60 ºC durante 15 seg y extensión a 72 ºC durante 15 seg. Tras los ciclos de amplificación, se realizó una curva de fusión para asegurar la especificidad de los productos amplificados.

El cálculo de la expresión génica se realizó usando los valores de “ciclo umbral” (Ct) proporcionados por el termociclador, mediante la ecuación e–ΔΔCt, donde e es la eficiencia de amplificación de cada gen, que fue cercana a 1 en todos los casos, y ΔCt se determinó restando el valor de Ct de la amplificación del ARN ribosómico 18S (control interno) al valor de Ct específico de cada gen de interés. Finalmente, el valor ΔΔCt se calculó restando el ΔCt de cada muestra problema al valor de la muestra utilizada como control (100%).

Para la cuantificación absoluta de cada uno de los transcritos de interés se amplificó en cada placa de PCR una curva estándar constituida por concentraciones conocidas crecientes del número de copias de ADNc del transcrito de interés, generada como se detalla en el siguiente apartado. De esta manera, la extrapolación de los resultados de la cuantificación de los genes de interés con los valores de la recta patrón permite determinar el número de copias específico de cada gen estudiado en cada una de las muestras problema.

3.4.5. Obtención de curvas estándar.

Para llevar a cabo la obtención de la curva estándar a utilizar para la cuantificación absoluta del transcrito de interés, se realizaron 8 reacciones de PCR convencional con los oligonucleótidos específicos de PCR a tiempo real de cada gen objeto de estudio, utilizando para ello el kit comercial 2X Master Mix PCR reagent. A continuación, se unió el producto de PCR de las 6 reacciones y se purificó el producto siguiendo las indicaciones del kit AccuPrepR Gel Purification Kit. Para confirmar que sólo se había amplificado una única banda del tamaño adecuado correspondiente al gen de interés, se realizó una dilución 1:800 y se hizo una electroforesis en gel de

agarosa al 1% con bromuro de etidio (0,4 µg/ml). La especificidad de los productos de PCR se determinó mediante la secuenciación de los mismos. A continuación, se determinó la concentración de los productos de PCR purificados mediante el kit comercial Picogreen DNA cuantificacion kit (Molecular Probes, Invitrogen), elaborándose la curva estándar mediante diluciones seriadas de los productos de PCR hasta obtener una recta patrón comprendida entre 1010 a 100 copias de cada gen de interés.

3.4.6. PCR convencional (PCR a tiempo final).

Para obtener los transcritos de los genes de interés en cantidad suficiente para la obtención de la curva estándar utilizada en la PCR a tiempo real para la cuantificación absoluta de los genes estudiados, se utilizó el sistema de PCR a tiempo final. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador iCycler IQ (Bio-Rad, Barcelona). Cada reacción consistió en una mezcla de 25 µl conteniendo 100 ng de ADNc como molde, dNTPs 100nM y el kit comercial 2X Master Mix PCR reagent. La amplificación de los diferentes genes se llevó a cabo siguiendo un programa de PCR tipo que consistió en un primer paso de desnaturalización a 94 ºC durante 4 min seguido por el número de ciclos determinado para la amplificación óptima de cada gen, normalmente unos 30-35 ciclos. A su vez, cada ciclo consistió en un paso de desnaturalización a 94 ºC durante 30 seg, alineamiento a 60 ºC durante 30 seg y extensión a 72 ºC durante 30 seg. La secuencia de los oligonucleótidos empleados se detalla anteriormente en la Tabla 3.