GEMSTAT-A improves expression prediction by reducing the contribution

y el alargamiento de las células corticales (Co). El meristema (me) es poco visible en la foto. Escala: 50 µm.

c) Ectendomicorrizas

Éstas corresponden a un tipo intermedio entre las endomicorrizas y las ectomicorrizas, ya que por un lado forman manto y retículo de Hartig, y además se produce la entrada del hongo en el interior de la célula (Reyna, 2000). Los hongos que forman este tipo de micorriza pertenecen a los Basidiomycotina. Las ectendomicorrizas arbutiodes se asocian con plantas de los géneros Arbutus, Arctostaphylos y Vaccinium (arándano) (Etayo y De Miguel, 1998).

Fuente: Reyna (2000).

Figura 9. Esquema de una ectendomicorriza. Se aprecia como el micelio del hongo penetra entre las células corticales formando retículo de Hartig y manto y además penetra dichas células.

4.1.2. Funciones de las micorrizas y usos por el hombre

Los árboles micorrizados obtienen una serie de ventajas de gran importancia para prosperar en el medio natural, ya que la micorriza otorga una serie de ventajas tanto a la planta como al suelo y su entorno ecológico.

La planta micorrizada posee una mejor capacidad de absorción de nutrientes ya que al ser mayor el volumen radicular aumenta la superficie de contacto entre raíz y suelo, puesto que la micorriza induce a la división radicular y al engrosamiento de ésta. Además el sistema radical se amplía a través del micelio extendido en el suelo, el cual es capaz de absorber sustancias simples, que luego pasan a la raíz y al árbol, mejorando el nivel de asimilación de macronutrientes, absorción de agua y oligoelementos. Entre esos nutrientes es el fósforo el que mejora más los niveles de asimilación, en este sentido se citan incrementos de hasta

Hifas del hongo

Células corticales de la planta

10 veces mayor asimilación de fósforo en plantas micorrizadas versus no micorrizadas. Por lo tanto, el efecto positivo más evidente, es un crecimiento más rápido que se traduce de una forma general por un aumento de la biomasa producida (Etayo y De Miguel, 1998; Callot, 1999; Reyna, 2000).

La planta micorrizada es más competitiva para captar agua del suelo, por consiguiente es mas tolerante a las situaciones de estrés en casos de sequías. Las micorrizas también otorgan a la planta un sistema de defensa contra enfermedades criptogámicas, tanto por la mayor vitalidad de la planta al estar mejor nutrida, como por la capa biológica de protección constituida por el manto fúngico que supone ya una barrera de entrada a los agentes parasitarios. Asimismo, en ciertos casos como la trufa, la producción de ciertos compuestos aleloquímicos evita la competencia de otras especies vegetales (Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

Según Etayo y De Miguel (1998), las micorrizas mejoran el enraizamiento y el establecimiento de las plantas, incrementan la captación de iones lentos, con lo que aumentan el crecimiento, facilitan el reciclaje de nutrientes en el sistema suelo-planta- atmósfera, mejoran las propiedades físico-químicas del suelo como la textura y estructura.

En la fase de vivero las micorrizas propician un mejor crecimiento y acumulación de reservas que sitúan a la planta en mejor posición para la futura plantación. Además, el desarrollo radicular más acentuado hace las plantas soporten mejor la fase de trasplante y aclimatación al campo (Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

En las comunidades naturales se ha desarrollado con el tiempo un equilibrio entre las plantas y sus hongos micorrícicos, pero en sistemas degradados se limitan las fuentes de propágulo, por lo que se hace necesaria la introducción de hongos micorrícicos. Actualmente en todas las estrategias de reforestación se tienen en cuenta las micorrizas como factor importante a la hora de favorecer el establecimiento de las plantas. La micorrización controlada, es también utilizada para facilitar las plantaciones de protección u ornamentales en condiciones difíciles, como por ejemplo la reforestación de suelos

perturbados de zonas de minería, excavaciones en obras públicas o terrenos inestables de montaña (Etayo y De Miguel, 1998).

Por último, se puede recurrir a las asociaciones micorrícicas con el objetivo de obtener carpóforos comestibles, como es el caso de las ectomicorrizas productoras de trufas o como también es el caso de los Boletus edulis ssp (Etayo y De Miguel, 1998).

4.2. Ciclo biológico

4.2.1. Diseminación de esporas

El carpóforo (trufa) alcanza su madurez plena desde mediados de invierno a principios de primavera. Debe liberar las esporas que encierra, lo que es facilitado por su intenso aroma que atrae a muchos animales que las consumen como alimento y también numerosos insectos e invertebrados, algunos de los cuales poseen una vinculación específica con la trufa. El jabalí por ejemplo excava la tierra en busca de la trufa y puede transportar pequeñas porciones de trufa adheridas a los labios o al pelo, hasta otros lugares. Otro “consumidor”, no tan voraz, pero si muy especializado en ellas, es la mosca de la trufa (Suillia fuscicornis y S. gigantea) de la familia Heliomyzidae, que ovipone en las trufas maduras, alimentándose sus larvas de ésta; contribuye activamente a la diseminación al quedar adheridas a las pilosidades de los adultos numerosas esporas. La dispersión real se produce cuando las esporas salen de las ascas, cuando el carpóforo esta en una etapa de hipermadurez o casi putrefacción. Mientras las esporas no se liberan de las ascas no se puede producir una verdadera diseminación, ya que éstas no germinan en el interior de las ascas por efectos de inhibidores de la germinación (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Las esporas liberadas de las ascas, una vez que alcanzan el suelo, son arrastradas hacia su matriz por efecto de las lluvias, siendo lixiviados los inhibidores germinativos. Cuando alcanzan la temperatura y humedad adecuada (a mediados de la primavera), la espora comienza a germinar emitiendo un finísimo filamento de micelio que se ramifica rápidamente, suceso que ha sido muy escasamente observado, in vitro o in situ. El micelio derivado de los tubos germinativos nacidos de las ascosporas, podría tener dos destinos distintos: una es la vía vegetativa, que acaba en la formación de micorrizas, al entrar en contacto con raíces cortas; y la otra corresponde a la via sexual, cuando los filamentos reproductores que inducen la formación de un primordio, se hallan en la vecindad de ciertas raíces largas (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Fuente: Reyna (2000).

Figura 10. Espora de T. melanosporum germinando.

4.2.3. Infección de raíces

El filamento miceliar emitido por la espora comienza a explorar el suelo en busca de alguna raicilla a la cual infectar. Dicho crecimiento posee un tiempo limitado por el agotamiento de las reservas energéticas. Al ponerse ésta en contacto con la raicilla de algún hospedero adecuado, se comienza a formar la micorriza, proceso conocido como infección primaria. El micelio se desarrolla penetrando en el interior del cortex de las raíces formando el retículo de Hartig y en el exterior forma el manto del que se originan nuevas hifas que van a

infectar las raicillas más cercanas. Estas nuevas raicillas infectadas (o expansión de la micorriza) se denominan infección secundaria. En ciertas zonas del sistema radical la infección micorrícica provoca una abundante división radicular y una acumulación o glomérulo de micorrizas bastante compacto. Todo el proceso de infección se extiende por el suelo y el sistema radical, hasta alcanzar una cierta biomasa crítica de micorrizas, a partir de la cual, si las condiciones son adecuadas, se puede producir la fructificación. Bajo condiciones de cultivo, con planta inoculada, se ha establecido que el ciclo completo requiere de entre 5 a 10 años. Dentro de esta fase, en la que se produce una clara simbiosis, también se produce la colaboración de bacterias que mejoran y estimulan el proceso micorrícico, puesto que ayudan a acidificar el medio favoreciendo el desarrollo en extensión del micelio (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Cuando las raíces van cesando en su crecimiento producto de un déficit hídrico, van pasando de color blanco a un color café claro. Este cambio de color se produce por modificaciones anatómicas ligadas a depósitos de lignina, complejos tanino-proteínas, compuestos fenólicos con incorporación de aminoácidos y péptidos en la pared celular, sobretodo en el súber y la endodermis, proceso conocido como metacutinización, que permite a las raíces resistir a condiciones más secas. Esta acumulación de lignina y taninos ricos en nitrógeno, es muy importante, puesto que éstas son las sustancias nutricionales más favorables para el desarrollo de la trufa y para la mantención de una buena micorrización (Callot, 1999).

4.2.4. Formación de trufas

A partir de los meses de octubre-noviembre, parte de los filamentos miceliares empiezan a diferenciarse, agrupándose y compactándose hasta dar lugar a la formación de un pequeño núcleo o primordio de la futura trufa (Reyna, 2000). Los primordios jóvenes poseen tres partes; una parte basal, que constituye el “pie”, que produce varios filamentos que recubren la estructura en formación, una parte media ascogonial, con un citoplasma denso, envuelto por filamentos jovenes y una parte terminal o tricogino, enrollado alrededor de una hifa

miceliar o filamento estéril a modo de sujeción. Estos primordios de color claro, se vuelven globulosos en el transcurso de su crecimiento y se transforman en bosquejos conteniendo, por definición, un centro fértil y una cobertura. Ésta se tiñe progresivamente de un color anaranjado (Figura 11) que facilita su localización desde la tierra (Callot, 1999).

Fuente: Callot (1999).

Figura 11. Evolución morfológica de los primordios de T. melanosporum. rl: raíz larga; *: cráter.

Desde el punto de vista morfológico, el joven primordio muestra una polaridad, a menudo subrayada por el hecho de que su base está en contacto con una raíz larga, con un ensamble que presenta la forma de una pipa (Figura 11). El polo apical presenta una cavidad que, en el curso de su desarrollo, se llena progresivamente de filamentos formando un enfurtido blanquecino, esta cavidad abierta hacia el exterior se halla tapizada de una empalizada de

paraphyses o células alargadas (Figura 12). La periferia primero lisa y amarillenta ocre, se

tiende a colorear anaranjada. Correlativamente las escamas prominentes se forman progresivamente a partir de la base hacia la parte superior, constituyendo ellas el inicio del peridio. A lo largo del crecimiento del primordio, en la base de éste, los restos de filamentos ascogoniales, producen los primeros elementos del aparato esporofítico (Callot, 1999).

Fuente: Callot (1999).

Figura 12. Estructura detallada de un primordio de trufa en estado apotecioide. La cavidad está a punto de cerrarse y se aprecian en el interior las venas estériles (más claras) rodeando las venas fértiles (sp) y el peridio escamoso envuelve el porimordio. c: canal; e: escamas; pr: paráfises; sp: aparato esporofítico.

Luego, comienzan a acercarse los bordes de la cavidad para posteriormente sellarse, cerrándose así la cavidad. El primordio se vuelve globuloso y se conforma la estructura característica de un ascocarpo juvenil que contiene un delgado peridio escamoso alrededor de una voluminosa gleba interna. Esta se halla formada por venas estériles sinuosas y ramificadas, correspondiendo a restos de la cavidad, y por venas fértiles estrechamente moldeadas entre las venas estériles que contienen el aparato esporofítico, que producirá las ascas cuando llegue a su madurez (Callot, 1999).

4.2.5. Fase saprófita

De acuerdo con Callot (1999) y Reyna (2000), a finales de la primavera principios de verano, se inicia una fase saprofítica en la trufa. En esta etapa, el carpóforo se independiza de la micorriza y se alimenta a partir de sustancias orgánicas presentes en el suelo a través de hifas miceliares presentes en la punta de las escamas. Al mismo tiempo comienza un engrosamiento considerable de la trufa y es necesaria una cierta cantidad de lluvia para que los carpóforos lleguen a madurar y alcancen un tamaño ostensible. A finales del verano comienzan a diferenciarse las esporas. A medida que prosigue la maduración se produce la emisión de aromas, llegando a su máximo cuando la trufa alcanza la plena madurez. En esta etapa el peridio constituído por escamas piramidales de base poligonal se tornan completamente negras y las ascas se han formado en la gleba otorgándole un color café oscuro a las venas fértiles. El ciclo de crecimiento del cuerpo fructífero de la trufa dura aproximadamente ocho meses a partir de los primeros primordios hasta que madura plenamente.

Entre los elementos nutritivos necesarios para su crecimiento los más importantes son el nitrógeno y el carbono. En condiciones de laboratorio el crecimiento del micelio es óptimo con una fuente nitrogenada proveniente de aminoácidos a pH 5,5 y mínima con una fuente en forma de nitrato y a pH 7 no se observa ningún crecimiento. Estos resultados parecen sorprendentes sabiendo que la trufa se desarrolla en medios calcáreos, con pH superior a 7, y que en estos medios el nitrógeno se haya generalmente en forma de nitrato. Esto demuestra que los hongos que se desarrollan en medios alcalinos poseen enzimas capaces de reducir el anión nitrato. Además se ha demostrado la presencia de cuatro aniones orgánicos: en baja cantidad oxalato y malato y en mayor cantidad succinato y por sobre todo citrato (Callot, 1999).

El micelio de la trufa es capaz de utilizar numerosas fuentes de carbono. En cultivo in vitro, la manosa y la sacarosa parecen ser las mejores fuentes de carbono con una fuente de

nitrógeno amoniacal, a pH 6. La manosa es una azúcar que se encuentra en las paredes de las células vegetales, lo que explica la colonización del micelio de trufa en las células de las raíces. La fuerte capacidad de utilización de sacarosa, azúcar muy presente en la savia elaborada de los vegetales, es también compatible con la existencia de la fase micorrítica. El micelio de trufa utiliza entonces fuentes de carbono de compuestos simples, lo que indica una capacidad saprofítica de tipo primario. Ciertos compuestos aromáticos (ácido quínico) en la base de polímeros como la lignina y los taninos, son también favorables al micelio de la trufa, que presenta igualmente una capacidad saprofítica secundaria permitiéndole degradar moléculas carbonatadas más complejas, polimerizadas. Por medio de compuestos testeados, la quitina y los taninos son los sustratos más favorables para el crecimiento del micelio de T. melanosporum. El desarrollo de los micelios presenta siempre un aspecto difuso, salvo en presencia de quitina y de ácidos húmicos. Esta capacidad saporofítica secundaria del micelio esta ligada a la secreción de enzimas de degradación del almidón, de la celulosa, de las ligninas y de la quitina (Callot, 1999).

4.2.6. Resumen del ciclo biológico

A continuación se presenta un resumen del ciclo biológico de Tuber melanosporum. En la Figura 13, se aprecia que un filamento miceliar (A) en contacto con una raíz larga se transforma en un primordio apotecioide (B a F), que crece y se vuelve autónomo. Enseguida, el primordio se cierra y adquiere una forma globulosa (G) presentando la estructura característica de la trufa, con una gleba envuelta por un peridio escamoso negruzco (H). A partir de este estado, el ascocarpo juvenil crece enormemente, las escamas del peridio y las venas de la gleba de multiplican activamente al mismo tiempo que las ascas y las ascosporas llenan completamente la gleba. En la madurez (H), las ascas comprimen y fermentan las venas estériles.

Fuente: Callot (1999).

Figura 13. Desarrollo del ascocarpo de T. melanosporum desde un filamento miceliar (A), pasando por un primordio apotesioide (B) que se expande (C-G) hasta llegar a transformarse en una trufa madura (H).

4.3. Fijación de CO2 por el ascocarpo

A pesar de su carácter heterotrófico, ciertos hongos son capaces de fijar y metabolizar el CO2 atmosférico. Recientemente se ha puesto en evidencia que el fenómeno de fijación de CO2 ocurre en especies de hongos micorríticos como Pisolithus tinctorius (Pers.) Cooker et Couch., Paxillus involutus (Batsch : Fr.), y en los cuerpos fructíferos enteros de Agaricus

campestris L. (Callot, 1999).

El ambiente en el que se desarrollan las trufas es muy rico en carbonato y oxalato de calcio y la atmósfera del suelo, bajo ciertos casos, puede encerrar importantes cantidades de CO2, superiores a 2-5 %. En experimentos con ¹⁴CO2 para demostrar la fijación de CO2 por parte de T. aestivum y T. melanosporum, se concluyó que en el caso de T. melanosporum, la fijación puede alcanzar valores iguales a 10 µg de carbono por gramo de trufa (peso seco) por hora. Esto representa el equivalente a un 8 a 10 % del CO2 respirado por estas mismas trufas. El carbono fijado es incorporado en diferentes estructuras orgánicas, particularmente en: 20 % en azucares neutras, 45 % en aminoácidos (principalmente ácido aspártico y glutamina) y 33 % en ácidos orgánicos (ácido málico). Las cantidades de CO2 fijadas varían según el estado fisiológico del ascocarpo, obteniendo los valores más elevados los más jóvenes. Al parecer la vía más importante de fijación de gas CO2 sería por intermedio de la enzima piruvato carboxilasa, que transforma el piruvato en oxalacetato al adquirir una molécula de CO2 (Callot, 1999).

5. Ecología

5.1. Distribución mundial

La trufa negra silvestre se encuentra exclusivamente en Europa en áreas de régimen estrictamente mediterráneo, concentrándose en éstas zonas casi la totalidad de su producción, y también las encontramos en áreas de régimen atlántico con sequía estival poco pronunciada como es el caso de Perigod, en Francia, o el País Vasco, en España. Y en climas temperados húmedos y calurosos, encontrándose trufas en el norte y sur de China y en América del norte (California y Texas) (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Naturalmente la trufa negra se recolecta entre los paralelos 37 y 47º LN, concretamente en los siguientes países: Alemania, Bulgaria, España, Francia, Grecia, Hungría, Italia, Portugal, Yugoslavia y probablemente Checoslovaquia. La trufa es realmente importante en Francia, Italia y España que son los países que concentran el 90% de la producción mundial (Pacioni, 1987; Reyna, 2000).

Fuente: Plantin, truffles and mushrooms (2006).

Figura 14. Distribución natural de las trufas negra y blanca (T. melanosporum y T.

magnatum).

La trufa también puede ser cultivada inoculando árboles forestales en la etapa de vivero. La técnica se desarrolló en Francia e Italia y luego fue aplicada en España, Nueva Zelanda, Estados Unidos y Australia (Tasmania), donde ya existen cultivos en producción. Además se conocen trabajos al respecto en Israel, Sudáfrica y Argentina. Todos países poseedores de clima templado y mediterráneo (Callot, 1999; Reina, 2000; Ramirez, 2003).

Actualmente en Chile se desarrollan proyectos para evaluar el establecimiento de T.

melanosporum en el país. Uno es ejecutado por la Universidad Católica del Maule y el otro

por el Instituto Forestal. Ambos proyectos están orientados a experimentar el resultado de la inoculación en diferentes especies leñosas como hospederos y a evaluar su prendimiento en terreno (Álvarez, 2004).

5.2. Simbiontes de T. melanosporum

Antiguamente la relación entre la producción de trufas y las especies arbóreas a las que se asocia T. melanosporum era desconocida. Sin embargo, a mediados del siglo XIX, el

agricultor francés Joseph Talon desarrolló el concepto de establecer bosques de encinos para obtener trufas, siendo el principio de la denominada época dorada de la trufa en Francia, al ser una alternativa viable al cultivo de la vid que estaba siendo arrasado por la filoxera (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Distintos autores, de entre los cuales Etayo y De Miguel (1998) y Reyna (2000), citan las siguientes especies (Cuadro 5), reportadas como simbiontes naturales de T. melanosporum, las cuales serían susceptibles también de ser micorrizadas artificialmente para su cultivo, según la región climática:

Otros autores citados por Bonet (2006) incluyen en la lista de huéspedes de T.

melanosporum a especies arbóreas del género Cistus, incluídos: C. albidus, C. incanus, C. laurifolius y C. salvifolius y también a algunas especies de los géneros Larix, Cedrus, Betula, Carpinus y Salix.

Cuadro 5: Especies vegetales leñosas que forman asociación simbiótica naturalmente con el hongo Tuber melanosporum. La mayor parte de éstas corresponde a especies de importancia forestal.

Castanea sativa Quercus coccifera Cistus spp. Quercus faginea Corylus avellana Quercus ilex Fagus sylvatica Quercus petrae Fumana spp. Quercus pubescens Ostrya carpinifolia Quercus robur Pinus nigra Quercus suber Populus spp. Tilia platiphyllos Quercus cerris