CHAPTER TWO – PHASE ONE: THE 1870 GENERATION (1870-1876)
2.2. The 1870 Generation
La determinación de la actividad fosfotirosina fosfatasa (PTP) se realiza conforme a una modificación del método descrito por Colás y col. (1992). En este método, se cuantifica el 33P liberado a partir de un sustrato fosforilado, un polipéptido sintético formado por glutamina y tirosina en una proporción 4:1 [poli-(Glu:Tyr)].
Este poli-(Glu:Tyr) se fosforila en los residuos de tirosina gracias a la actividad tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), receptor que se encuentra sobreexpresado en las membranas de las células de la línea A-431. Esta línea celular deriva de un carcinoma epidérmico establecido a partir de tumores sólidos por Giard y col. (1973).
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalá 11.1. PREPARACIÓN DE MEMBRANAS DE CÉLULAS A-43111.1.1. Reactivos
● Medio de cultivo DMEM con 10% de suero fetal bovino y 1% de antibióticos
● Tampón fosfato salino (PBS) pH 7,0:
9 NaH2PO4 10 mM 9 KH2PO4 1,76 mM 9 NaCl 150 mM 9 KCl 2.7 mM ● Tampón “C”: 9 Tris-HCl 50 mM pH 7,5
9 Inhibidor de tripsina de soja (STI) 0,03% 9 Bacitracina 0,5 mg/ml
11.1.2 Método
Las células se cultivan en medio DMEM alcanzar el 100% de confluencia. Una vez confluentes, se lavan las células con PBS, se levantan con un raspador de goma y se recogen en este mismo tampón. A continuación se centrifugan los tubos a 150 x g durante 5 minutos a 4ºC y se resuspenden las células en tampón “C”. Después, se lisan las células mediante choque térmico, congelando rápidamente a -80ºC y descongelando en baño a 37ºC. Una vez lisadas, se centrifugan los tubos a 150 x g durante 5 minutos, eliminándose en el sedimento núcleos y células muertas. El sobrenadante se centrifuga a 25000 x g durante 30 minutos y el sedimento, que contiene las membranas crudas, se resuspende en tampón “C” y se conserva a -80ºC.
11.2. MARCAJE DEL POLI-(GLU:TYR) CON 33P 11.2.1. Reactivos ● Tampón de marcaje: 9 Tris-HCl 50 mM pH 7,5 9 Ortovanadato de sodio 100 μM 9 MnCl2 5 mM ● Tampón de elución: 9 Tris-HCl 50 mM pH 7,5
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalá● Mezcla de marcaje (se prepara en el momento):
9 1-2 mg de membranas de células A-431 en 507,5 μl de tampón de marcaje 9 213 μl de tampón de marcaje
9 7,2 mg de poli-(Glu:Tyr) en 150 μl de tampón de marcaje 9 10 μl de Igepal CA-630 (Nonidet P-40) 10%
9 66 μl de EGF 10-5 M en tampón de marcaje 9 12,5 μl de ATP 20 mM en tampón de marcaje
9 41 μl de γ-[33P]-ATP 250μM en tampón de marcaje (aprox 85 μCi) 11.2.2. Método
En un tubo Eppendorf, se prepara la mezcla de marcaje y se deja incubando a 4ºC durante 16 horas en rotación. Transcurrido ese tiempo, la mezcla se deposita en una columna de Sephadex G-25 (medio) (PD-10 Amersham) a 4ºC y se eluye con tampón de elución frío a un flujo de 0,20 ml/min. Se recogen fracciones de 500 μl, se toma de cada fracción una alícuota de 10 μl, se añaden 2 ml de líquido de centelleo y se llevan a un contador β (Wallac Pharmacia 1410). Se recogen las fracciones que contienen el 33P-poli-(Glu:Tyr) (Figura 35) y se concentran con un microconcentrador Amicon Ultra 4 (Millipore). Tras concentrarse, se toma la fracción superior y se añade un volumen de tampón de elución. Se preparan alícuotas de 100 μl y se conservan a -20ºC hasta el día del ensayo (máximo un mes).
c. p .m. x10 3 250 200 150 100 50 0 10 20 30 40 50 33P-poli-(Glu:Tyr) Nº tubo 0 γ-[33P]-ATP
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalá 11.3. VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD FOSFOTIROSINA FOSFATASA11.3.1. Reactivos ● Tampón PTP: 9 Tris-HCl 50 mM pH 7,0 9 BSA 0,1 % 9 Ditiotreitol 5 mM 9 STI 0,01 % 9 PMSF 0,1 mM 9 EDTA 1 mM 9 MgSO4 5 mM
●33P-poli-(Glu:Tyr) a una concentración de 1 μM (aprox 1000 c.p.m./μl)
● SQ 22536 (Inhibidor de la AC) 5x10-4 M en tampón PTP
● SST 7x10-4 M en tampón PTP
● Solución iniciadora (ATP 20 mM, GTP 12 μM en tampón PTP)
● BSA 0,5 mg/ml en tampón PTP
● Ácido tricloroacético (TCA) 30%
● Solución quelante:
9 Molibdato amónico 1% 9 H2SO4 210 mM
● Isobutanol:Tolueno (1:1)
11.3.2. Método para valorar la actividad PTP basal
Se añaden a tubos eppendorf por duplicado 70 μl de membranas procedentes de hipocampo resuspendidas en tampón PTP a una concentración de 0,5 mg/ml o bien 70 μl de BSA 0,5 mg/ml para los inespecíficos. Se atemperan los tubos 5 minutos a 30ºC y se añade 30 μl de 33P-poli-(Glu:Tyr) 1 μM (aproximadamente 30000 c.p.m.) agitando en vórtex. Se incuban los tubos durante 10 minutos en baño con agitación y, transcurrido este tiempo, se añaden a cada tubo 100 μl (un volumen) de TCA 30% para detener la reacción.
Se dejan reposar los tubos 30 minutos en hielo para que precipiten las proteínas y se centrifugan a 10000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se toman 150 μl del sobrenadante, donde se encuentra el 33P liberado y se añade un volumen de solución quelante. Se incuban 10 minutos los tubos a 30ºC, se añade 1 ml de isobutanol:tolueno y se agitan fuertemente en un
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalávórtex. Se centrifugan los tubos a 250 x g durante 5 minutos para que se formen dos fases, se toman 600 μl de la fase orgánica superior, se añaden 2 ml de líquido de centelleo y se llevan a contar a un contador β (Wallac Pharmacia 1410).
La hidrólisis no enzimática (inespecífica) del sustrato fosforilado se corresponde con los tubos que llevan BSA en lugar de membranas de hipocampo y se resta de la actividad de las muestras para calcular la actividad PTP específica. Una unidad de actividad PTP puede definirse como la cantidad de enzima que libera 1 nmol de fosfato del sustrato marcado/min/mg proteína.
11.3.3. Método para valorar la actividad PTP estimulada por somatostatina
Para poder valorar la actividad PTP estimulada por SST es necesario añadir al medio de ensayo ATP y GTP para que se produzca la activación de las proteínas Gi y de las PTP dependientes de la vía de la SST. No obstante, para evitar que el ATP sea transformado enzimáticamente a AMPc por la AC, retirándolo del medio, se hace necesario inactivar esta enzima con un inhibidor específico, el SQ 22536.
De cada muestra o inespecífico se realizan dos duplicados, uno de ellos para medir la actividad basal y otro para medir la actividad estimulada por SST. Se añaden a tubos tipo eppendorf 40 μl de membranas de hipocampo a una concentración de 0,875 mg/ml, o bien 50 μl de BSA 0,5 mg/ml para los inespecíficos, y 10 μl de SQ 22536 5x10-4 M. Se preincuban 30 minutos a 30ºC en baño con agitación para que se produzca la inhibición de la AC. A continuación, se van añadiendo a los tubos para medir la actividad basal 10 μl de BSA 0,5 mg/ml y a los tubos para medir la actividad estimulada 10 μl de SST 7x10-4 M. Finalmente, se añaden a todos los tubos 10 μl de la solución iniciadora y se dejan incubando 10 minutos a 30ºC en baño con agitación. Transcurrido este tiempo, necesario para la activación de la vía de la SST, se van añadiendo, en intervalos de 10 segundos, 30 μl de 33P-poli-(Glu:Tyr) 1 μM (aproximadamente 30000 c.p.m.), agitando en vórtex. El resto del procedimiento es similar al descrito en el apartado anterior.