CHAPTER TWO – PHASE ONE: THE 1870 GENERATION (1870-1876)
2.3. The Rhetoric of Decadence
12.1. EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL 12.1.1 Reactivos
● Tri-Reagent
● Agua dietilpirocarbonato (DEPC):
9 Se añade DEPC en agua bidestilada hasta una concentración de 0,01%. Se deja toda la noche a 60ºC, se autoclava y se guarda a temperatura ambiente protegido de la luz.
● Cloroformo
● Isopropanol
● Etanol al 75%
9 Enrasamos a 100 ml con agua DEPC 78,125 ml de Etanol 96º. 12.1.2. Método
El ARN total se extrae de 50 mg de hipocampo de acuerdo con el protocolo de Tri- Reagent proporcionado por Sigma. Las muestras se homogeneizan a temperatura ambiente en 1 ml de Tri-Reagent utilizando un homogeneizador Potter con vástago de teflón autoclavado. A continuación se añaden 200 μl de cloroformo, se agitan fuertemente las muestras durante 15 segundos y se mantienen durante 10 minutos a temperatura ambiente para deshacer los complejos de nucleoproteínas. Transcurrido ese tiempo, se centrifugan los tubos a 12000 x g 15 minutos a 4ºC. Se transfiere la fase acuosa superior a tubos nuevos y se le añade 500 μl de isopropanol. Se agitan los tubos con suavidad y se mantienen otros 10 minutos a temperatura ambiente para que el ARN precipite. A continuación, se centrifugan 10 minutos a 12000 x g y se descarta el sobrenadante. El precipitado se lava dos veces con 1 ml de etanol al 75%. Finalmente se dejan secar los precipitados a temperatura ambiente y se resuspenden en 50 μl de agua DEPC.
12.2. PURIFICACIÓN DEL ARN TOTAL CON ADNasa I
Debido a que la extracción con el TriReagent puede dejar trazas de ADN genómico en las muestras, es necesario someterlas a una digestión con ADNasa I y a una posterior fenolización para purificar las muestras y mejorar la especificidad de la PCR.
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalá12.2.1. Reactivos ● ADNasa I
● Tampón ADNasa I 10X:
9 Tris-HCl 500 mM pH 7,6 y MgCl2 500 mM en agua DEPC ● Tampón de parada 10X:
9 EDTA 500 mM pH 8,0 y SDS 2% en agua DEPC ● Fenol:
9 Antes de usar el fenol, hay que saturarlo con Tris-HCl pH 8,0 para mejorar la extracción del ARN. Para ello, se añade un volumen de Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 y se agita la mezcla durante 15 minutos. Una vez separadas las dos fases se aspira la fase acuosa y se comprueba que el pH del fenol es igual o superior a 8,0 con papel de tornasol, repitiendo el proceso si fuera preciso. Finalmente, se añaden 0,1 volúmenes de la solución de Tris para conservar el fenol.
● Cloroformo
● Alcohol isoamílico
● Acetato sódico 3 M
● Etanol al 75%
● Etanol 96º frío
12.2.2. Digestión con ADNasa I
Tras determinar la concentración de ARN mediante la absorbancia a 260 nm, se toman 20 μg de muestra y se añaden a un tubo que contiene 10 μl de Tampón ADNasa I y 10 μl (100 UI) de ADNasa I en un volumen final de 100 μl. Se homogeneiza cada mezcla de reacción por pipeteos sucesivos y se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Transcurrido ese tiempo, se añaden 10 μl de tampón de parada 10X, se mezclan y se incuban los tubos 10 minutos más a 37ºC.
12.2.3. Purificación con fenol
Una vez detenida la reacción de digestión, se añade a cada tubo un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (1:1:0,02) y se agita el tubo con un vórtex durante 30 segundos. A continuación, se centrifugan las muestras 15 minutos a 12000 x g y se recogen los sobrenadantes. Se añaden 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M y 2,5 volúmenes de etanol frío y, tras agitar suavemente, se incuban las muestras toda la noche a -20ºC para que
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalá el ARN precipite. Al día siguiente se centrifugan los tubos a 12000 x g 15 minutos a 4ºC y se descartan los sobrenadantes. Los precipitados se lavan dos veces con 1 ml de etanol al 75% y, finalmente, se dejan secar a temperatura ambiente y se resuspenden en agua DEPC.12.3. COMPROBACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL ARN 11.3.1. Reactivos
● MOPS 10X:
9 MOPS 200 mM 9 Acetato sódico 50 mM 9 EDTA 10 mM
● Tampón de muestras desnaturalizante:
9 12% Agua DEPC
9 50% Formamida desionizada 9 10% MOPS 10X
9 7% Formaldehído
9 1% Bromuro de etidio 1mg/ml
9 20% Azul de bromofenol (0,2 mg/ml) disuelto en glicerol:agua DEPC (1:1) ● Gel desnaturalizante de agarosa al 1%:
9 1% Agarosa 9 10% MOPS 10X 9 5% Formaldehído 9 84% Agua DEPC 12.3.2. Método
Una vez aislado y purificado el ARN total, se comprueba la integridad del mismo. Para ello se toma 1 μg de ARN al que le añadimos 2 μl de tampón de muestras desnaturalizante para después enrasar a 12 μl finales con agua DEPC. Las muestras se calientan entonces a 70ºC durante 5 minutos para desnaturalizar el ARN y se enfrían rápidamente en hielo para evitar la renaturalización. A continuación, se cargan las muestras en un gel desnaturalizante de agarosa al 1% y se realiza una electroforesis a 150 voltios. Por último, se visualiza el gel en un transiluminador ultravioleta. Si el ARN está intacto se observarán dos bandas correspondientes al ARN ribosómico (ARNr) de 18 y 28 Svedberg
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalá(S), siendo la banda de 28 S el doble que la de 18 S (Figura 36A). Si, por el contrario, el ARN se ha degradado, aparecerán bandas secundarias o una mancha difusa (Figura 36B)
12.4. AISLAMIENTO DEL ARNm A PARTIR DEL ARN TOTAL
Una técnica habitual en el análisis de la expresión mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es diseñar cebadores a ambos lados de un intrón y correr las muestras en un gel de agarosa. Si la extracción de ARNm no ha sido buena y han quedado restos de ADN genómico, aparecerán dos bandas muy próximas para el mismo amplicón, una correspondiente al ARNm y otra al ADN genómico que, al mantener el intrón, presenta un mayor tamaño. Sin embargo, algunos de los genes de los receptores de somatostatina (SSTR) no poseen intrones intercalados en su región codificante, por lo que la única manera de asegurar la no existencia de ADN genómico en la muestra es purificarla con un método que permita extraer selectivamente el ARNm. En este trabajo se ha utilizado para este fin el kit comercial GenElute mRNA miniprep de Sigma.
12.4.1. Contenido del kit ● Agua estéril ● Columnas de filtración ● Microesferas de poliT ● Solución de unión 2X ● Tampón de lavado ● Tampón de elución A B 28 S 18 S
Figura 36:Película representativa de la integridad del ARN. En el panel A se pueden observar las dos bandas intactas correspondientes al ARNr de 28 S y 18 S mientras que en el panel B se observa una mancha difusa que se produce debido a la degradación del ARN.
Materiales y Métodos
Universidad de Alcalá 12.4.2. MétodoLas muestras de ARN total se diluyen hasta un volumen final de 250 μl con agua estéril. A continuación, se añaden a las muestras 250 μl de solución de unión 2X y 15 μl de microesferas de poliT que se unen a la cola de poliA característica del ARNm. Se incuban los tubos 3 minutos a 70ºC para desnaturalizar el ARN y se deja enfriar a temperatura ambiente durante otros 10 minutos, durante los cuales se produce la unión del ARNm a las microesferas. Se centrifugan las muestras a 15000 x g durante 2 minutos y se descarta el sobrenadante, que contiene el ARN no mensajero y los posibles restos de ADN. El precipitado se resuspende en tampón de lavado y se transfiere a columnas de filtración. Tras una nueva centrifugación a 15000 x g durante 2 minutos, las microesferas con el ARNm quedan retenidas en el filtro. A continuación, se lavan los filtros con 500 μl de tampón de lavado y se añaden 50 μl de tampón de elución calentado a 70ºC para disociar el ARNm de las microesferas. Tras una incubación de 5 minutos a 70ºC, los tubos se centrifugan de nuevo a 15000 x g durante 1 minuto y se recoge el eluido, que contiene el ARNm puro.