Hydrogels supporting MSC chondrogenesis

En los ensayos de mutagenicidad es necesario contar con cultivos de S. thyphimurium (TA98

y TA100) en una concentración del orden de 1 a 2.10

(TA98 y TA100)

9 _células.mL-1_{; para ello se realizó un}

ensayo para determinar la correlación entre el número de células.mL-1

Se construyeron curvas de densidad óptica a 650 nm (DO) vs. Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC.mL

y DO del cultivo en función del tiempo.

-1

Procedimiento:

).

Se tomaron dos colonias aisladas características de las placas maestras y se sembraron en un tubo de ensayo de 18mm x 150mm con 5 mL de Caldo Oxoid Nº2. Se llevó a incubar a 37ºC con agitación de 210 rpm. Se midió la densidad óptica luego de 4 horas y después se repitieron las medidas cada 45 minutos a 650 nm. Se sembraron por duplicado placas de Petri con agar nutritivo con distintas diluciones del cultivo para cada tiempo. Las diluciones se

80 realizaron sembrando 1mL del caldo en 9 mL de peptona 0.1% en agua destilada estéril. Se realizaron siembras en superficie tomando 100 µL de la dilución y se esparcieron con perlas de vidrio estériles haciendo diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4y 10-5. Luego se llevaron a incubar a estufa a 37º durante 24-48hs. El recuento en placa se realizó determinando el número de

Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC.mL-1) considerando cada dilución

sembrada y los valores tomados en la curva fueron resultado del promedio de recuento de los duplicados.

4.2.2.4. Procedimiento para la obtención de cultivos en fase estacionaria

Es lo que se conoce como cultivo de toda la noche o de 12 hs. Procedimiento:

Para cada experimento, los cultivos de las cepas de ensayo (TA98 y TA100) fueron crecidos en caldo nutritivo Oxoid Nº 2 durante toda la noche (12 horas) para obtener una densidad de 1 a 2 x 109 unidades formadoras de colonias (UFC.mL-1). Esta cantidad se verificó midiendo la turbidez del cultivo a 650 nm y se interpoló su valor en la curva de UFC.mL-1 vs. D.O. a esa longitud de onda. Cuando este valor se superaba, se agregaba una cantidad determinada de caldo estéril, de tal forma que se llegara a la cifra de bacterias.mL-1 buscada. Se usaron en los ensayos 100 µL de cultivo por placa. Para experimentos pequeños se crecieron los cultivos en 5 mL de medio en tubos de 18 x 150 mm con tapa. Para grandes volúmenes se usaron frascos de 100 cm3

El ensayo de mutagenicidad con Salmonella typhimurium, puede realizarse mediante dos

métodos:

con 20 ml de medio. Los cultivos se inocularon raspando la superficie de un criotubo de cultivo de trabajo para cada cepa y se incubaron a 37°C en un equipo rotatorio durante toda la noche. Para asegurarse una aireación adecuada, los mismos se agitaron a 210 rpm aproximadamente. Cuando se usaron frascos, la velocidad de rotación se disminuyó a 120 rpm para evitar la formación de espuma. Se colocaron los tubos o los frascos crecidos en un recipiente con hielo cuando eran sacados de la estufa y se mantuvieron allí hasta su uso en el ensayo de mutagenicidad.

a. Método de incorporación en placa también llamado Ames Clásico. b. Método de preincubación.

- Determinación de mutagenicidad por el Método de incorporación en placa

En el ensayo de incorporación en placa, las cepas Salmonella typhimurium TA98 y TA100 de

81

Luego se sembraron 100 μL de cultivo junto con el extracto vegetal (acuoso, clorofórmico o acetónico) de Ilex paraguariensis var. paraguariensis o Ilex dumosa var. dumosa (dilución

correspondiente a una concentración final de 0.45, 4.50 y 45.00 mg/placa) en tubos de 13 x 100 mm con tapa, que contenían 2.0 mL de agar Top con solución de 0.5 mM de histidina/biotina.

Los ensayos de mutagenicidad se desarrollaron con y sin activación metabólica, es decir, con 500 µL de S9 mix o 500 µL de buffer fosfato (composición en Anexo 1) respectivamente. El contenido de cada tubo fue vertido sobre placas de AGM. Después de un período de incubación de 48 horas (37ºC), se contaron las colonias revertantes His+. Se realizaron placas por triplicado en cada ensayo experimental. Los datos fueron expresados como la medio del número de colonias ± la desviación estándar de la media (S.D.). Se seleccionaron los

controles negativos (número de revertantes espontáneos) y positivos (mutágenos diagnóstico) para el test de Ames de acuerdo a la cepa de Salmonella typhimurium (His-) usada en

presencia/ausencia de S9 mix. En los casos donde se realizaron ensayos con extractos orgánicos de las plantas, se agregó un control de solvente, dimetilsulfóxido (DMSO, 500 µL) en lugar de buffer fosfato. Se usó 2AF (2.50 μg/placa) y 2NF (2.5 μg/placa) como mutágenos diagnóstico en TA98 con y sin S9 mix, respectivamente. Para TA100 con y sin S9 mix, se trabajó con 2AF (2.50 μg/placa) y SAZ (1.50 μg/placa), respectivamente.

- Determinación de mutagenicidad por el Método de preincubación

En el ensayo de preincubación, las cepas TA98 y TA100 de Salmonella. typhimurium (His-

La mezcla entera (Volumen final de 700µL) se homogeneizó y se preincubó a 37ºC durante 20 minutos sin agitación. Luego la misma se vertió en un tubo que contenía 2.0 mL de agar Top con solución 0.5 mM de histidina/biotina y se mantenía a 45ºC en un baño de agua a esa temperatura.

) fueron crecidas en caldo nutritivo Oxoid Nº2 durante toda la noche (12 hs, a 37ºC). Las cepas

del cultivo de toda la noche (100 μL) fueron mezcladas con S9 mix (500 μL) o con 500 µL de buffer fosfato y el extracto acuoso, clorofórmico o acetónico de hojas de Ilex paraguariensis var.paraguariensis o Ilex dumosa var.dumosa (100 μL de la dilución correspondiente a una

concentración final de 0.45, 4.50 y 45.00 mg/placa).

El contenido de cada tubo fue vertido sobre placas de AGM. Después de un período de incubación de 48 horas (37ºC), se contaron las colonias revertantes His+. El grado de reversión se comparó con las placas de control positivo y negativo. Se realizaron placas por triplicado en cada ensayo experimental. Los datos fueron expresados como la medio del

82 número de colonias±desviación estándar de la media (S.D.). Se seleccionaron los controles

negativos (número de revertantes espontáneos) y positivos (mutágenos diagnóstico) para el

test de Ames de acuerdo a la cepa de Salmonella typhimurium (His-) usada en

presencia/ausencia de S9 mix. En los casos donde se realizaron ensayos con extractos orgánicos de las plantas, se agregó un control de solvente, dimetilsulfóxido (DMSO, 500 µL) en lugar de buffer fosfato. Se usó 2AF (2.50 μg/placa) y 2NF (2.5 μg/placa) como mutágenos diagnóstico en TA98 con y sin S9 mix, respectivamente. Para TA100 con y sin S9 mix, se trabajó con 2AF (2.50 μg/placa) y SAZ (1.50 μg/placa), respectivamente.

- Consideraciones e interpretaciones de resultados

Para el estudio inicial de una sustancia química, se recomienda ensayar concentraciones en rango mayor a 3 logaritmos de dosis en presencia y ausencia de S9 mix, por eso se realizaron

las primeras determinaciones utilizando 0.45, 4.50, 45.00 mg/ placa para cada extracto de cada una de las plantas de Ilex paraguariensis St Hil. var. paraguariensis e Ilex dumosa Reissek var. dumosa. Cada resultado positivo o cuestionable fue confirmado por demostración de la

relación dosis respuesta, usando un rango más angosto de concentración.

Se determinó el factor de mutagenicidad (FM) para las dos variedades de Ilex ensayadas así

como para cada uno de los extractos estudiados: En valor de FM constituye la relación entre la frecuencia de revertantes His+ y la frecuencia de revertantes espontáneos. Una sustancia es considerada mutagénica cuando el factor de mutagenicidad es mayor a 2 (Mattern, 1981).

F.M.= Revertantes (a cierta conc. de sustancia)/ Revertantes espontáneos

Los datos obtenidos en los resultados fueron analizados por análisis de varianza (ANOVA) y a través de la prueba t de Student. El nivel de significación elegido fue de 0.05. Un análisis de

tendencia se llevó a cabo para evaluar si la relación dosis- respuesta que se evidenciaba en algunas concentraciones de los extractos era lineal.