IDENTIFICATION AND GENERAL CHARACTERISTICS

Se estima que para el tiempo en que el paciente típico es diagnosticado con Alzheimer la enfermedad ha progresado durante varios años, así que es crucial que ésta sea detectada lo más tempranamente posible. El diagnóstico clínico de EA no siempre es confiable, especialmente en etapas tempranas, por lo que se requieren biomarcadores para mejorar la sensibilidad y monitorear la actividad biológica en términos neuronales y de tiempo de progreso de la enfermedad. El uso de biomarcadores para predecir el desarrollo de Alzheimer entre individuos con deterioro leve podría producir beneficios terapéuticos y económicos sustanciales (Hyman SE, 2007).

4.2.1 Biomarcadores en líquido cefalorraquídeo

El LCR baña al cerebro y la espina y, por lo tanto, puede reflejar cambios patológicos que ocurren en el SNC, reflejando el estado del metabolismo proteico del cerebro. En el Alzheimer, los niveles de tau total (tTau) en el LCR están elevados (Vigo-Pelfrey C et al., 1995; Andersson C et al., 2007), aunque también se incrementan en la demencia vascular (Nagga K et al., 2002) y la demencia fronto-temporal (Green AJE et al., 1999). También se elevan los niveles de tau fosforilada (pTau) que, en contraste a tTau, parece ser un marcador más específico para la EA (Nagga K et al., 2002). Otro

biomarcador en LCR son los niveles reducidos de A 42; sin embargo, éste se ve también disminuido en otras demencias y por ello es un marcador no específico de Alzheimer (Sjögren M et al., 2000; Nagga K et al., 2002). Los niveles en LCR de los productos finales de glicosilación avanzada también ayudan en la detección temprana de la EA (Takeuchi M et al., 2007).

Marisol Herrera Rivero | Doctorado en Ciencias Biomédicas 41 Se ha encontrado una relación inversa entre la carga amiloide in vivo y los niveles de A 42 en LCR en humanos (Fagan AM et al., 2006). El LCR de los pacientes de Alzheimer, aún en etapas tempranas de la enfermedad, muestra valores disminuidos de A 42 y, junto con un valor incrementado de tTau o pTau, sugiere la presencia de disfunciones cognitivas aún en sujetos mayores sanos (Lewczuc P et al., 2004). El índice tau/A 42 en LCR es una predicción del declive cognitivo en adultos mayores no dementes (Lewczuc P et al., 2004; Fagan AM et al., 2006, 2007; Hansson O et al., 2007); junto con atrofia del lóbulo temporal medio (van de Pol LA et al., 2007) o FDG- PET (Fellgiebel A et al., 2007) y la presencia del alelo ApoE 4, estos marcadores predicen demencia en el deterioro cognitivo leve (DCL) o un mayor riesgo a desarrollar EA (Herukka SK et al., 2007), tal como lo hacen rCBF-SPECT (Huang C et al., 2007), hipoperfusión cerebral inducida por fMRI (Xu G et al., 2007), A 42 del plasma y homocisteína (Blasko I et al., 2008). A 42 soluble muestra no estar relacionado al grado de deterioro cognitivo (Stefani A et al., 2006) y el índice A 42/40, pero no A 42 solo, se correlaciona con pTau en pacientes con cargas altas y bajas de A 40 en LCR (Wiltfang J et al., 2007).

En el presente, la combinación de las proteínas tTau o pTau elevadas en LCR y A 42 disminuido son los únicos biomarcadores con suficiente sensibilidad y especificidad para servir como biomarcadores diagnósticos útiles capaces de distinguir el Alzheimer de otras demencias en etapas tempranas (Bailey P, 2007). En conjunto con imagenología y una historia clínica detallada, esta prueba puede ser implementada efectivamente y es el estándar con el que, hasta la fecha, deben ser comparadas todas las pruebas para biomarcadores moleculares de Alzheimer.

La elevación significativa de los niveles de BACE1 y su actividad en LCR es un indicador de marcadores neuroinmunes que indican Alzheimer (Zhong Z et al., 2007; Gruden MA et al., 2007). Los isoprostanos-F2 se elevan en el LCR y cerebro con Alzheimer (Pratico D et al., 1998). Estudios preliminares muestran que anticuerpos reactivos redox en LCR pueden representar un biomarcador valuable para el diagnóstico de Alzheimer (McIntyre JA et al., 2007).

Marisol Herrera Rivero | Doctorado en Ciencias Biomédicas 42 4.2.2 Biomarcadores en sangre periférica

Como alternativa al LCR, la sangre periférica provee una vasta fuente disponible para pruebas de laboratorio. La ventaja principal de usar sangre en lugar de LCR como fuente de un biomarcador para EA es que ésta puede obtenerse fácilmente de los pacientes y evita la necesidad de punción lumbar, que es un procedimiento relativamente invasivo y potencialmente peligroso de practicar en pacientes dementes. Se sugiere que la integridad de la barrera hematoencefálica se compromete en estados de enfermedad que incluyen el Alzheimer (Persidsky Y et al., 2006) y es posible que cambios metabólicos centrales también puedan ser anómalos en la periferia; así, la sangre puede reflejar el estado del SNC. Un biomarcador molecular en sangre periférica que pueda clasificar la enfermedad e identificar aquellos individuos presintomáticos con DCL que, eventualmente, se convertiría en Alzheimer sería particularmente útil. Se han descrito en la literatura numerosos biomarcadores sanguíneos (Tabla 5), pero hasta ahora ninguno de ellos ha sido suficientemente validado para su uso rutinario en la clínica.

Debido a que el cerebro controla muchas de las funciones del cuerpo mediante la liberación de proteínas de señalización y a que los mecanismos inmunes centrales y periféricos e inflamatorios están implicados en la EA y enfermedades relacionas (Wyss- Coray T, 2006), se ha hipotetizado que el proceso patológico que lleva al Alzheimer puede causar cambios característicos de estas proteínas en la sangre, generando un fenotipo molecular detectable específico de la enfermedad que permita el desarrollo de una prueba simple y de bajo costo para la EA (Ray S et al., 2007). Las concentraciones plasmáticas de muchas proteínas de señalización secretadas difieren considerablemente entre sujetos con EA e individuos no dementes. Un patrón de expresión de proteínas distinto al de los sujetos no dementes se asocia con la EA. Se indica que un fenotipo altamente específico de biomarcador plasmático puede caracterizar la enfermedad años antes de que pueda realizarse un diagnóstico clínico.

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Marcadores relacionados con el metabolismo de APP y A

Péptidos A (A total, A 40y A 42)

Flujo de A cerebro-plasma

Autoanticuerpos A

Isoformas plaquetarias de APP Actividad BACE1

Marcadores relacionados con el metabolismo del colesterol y enfermedad vascular Colesterol 24S-hidroxicolesterol Apolipoproteína E Lp(a) Homocisteína Marcadores de oxidación

Niveles de antioxidantes (caroteno, licopeno, vitaminas A, C y E, urato y bilirrubina)

Peroxidación lipídica (isoprostanos-F2, 4-hidroxinonenal)

Marcadores de inflamación Proteína C reactiva IL-1 TNF-α IL-6 y su receptor Antiquimiotripsina-α1 Otros marcadores propuestos

p97 GSK3 MAO-B

Fosfolipasa-A2 Macroglobulina-αβ

Factor H del complemento

Tabla 5. Principales biomarcadores sanguíneos propuestos para la EA.

La desregulación de vías de señalización en el plasma puede indicar cambios en la periferia, el SNC o ambos, que son específicos a la EA y ocurren en etapas tempranas. Como soporte a las manifestaciones periféricas de neurodegeneración, patrones de expresión genética diferencial en células sanguíneas pueden predecir tempranamente la enfermedad de Parkinson (Scherzer CR et al., 2007; Maes OC et al, 2007). Se han reportado diferencias en la distribución de subpoblaciones de linfocitos en la sangre o secreción diferencial de citocinas de las células sanguíneas en individuos con DCL o EA (Wyss-Coray T, 2006; Ray S et al., 2007).

Marisol Herrera Rivero | Doctorado en Ciencias Biomédicas 44 Algunos biomarcadores séricos basados en el proteoma han mostrado especificad para EA y se correlacionan con la severidad de la enfermedad, aunque son necesarios ensayos alternativos para mejorar la sensibilidad y especificad (Lopez MF et al., 2005). Los marcadores candidatos propuestos previamente incluyen: A , tau, glutamin sintasa, ApoE, antiquimiotripsina-1 y quimosinas, entre otros.

El amiloide total del plasma o A 42 se incrementa en casos de FAD (Scheuner D et al., 1996) y trisomía 21 (Schupf N et al., 2001), pero no se relaciona consistentemente al diagnóstico clínico del Alzheimer típico (Scheuner D et al., 1996; Fukumoto H et al., 2003), pues no se eleva en los casos esporádicos. Niveles elevados de A 42, niveles

bajos de A 40 y un índice reducido de A 42/40 en plasma en sujetos mayores indican una conversión de la normalidad cognitiva al DCL o EA. Sin embargo, otros han encontrado que una disminución en los niveles plasmáticos de A 42 puede ser un marcador para el estado de EA, específicamente la transición del estado normal o DCL a EA, en lugar de un marcador para el proceso neurodegenerativo que ocurre en la enfermedad (Pesaresi M et al., 2006).

Debido a una alta variabilidad intra e interpersonal de los niveles plasmáticos y séricos

de A (Abdullah L et al., β007), el origen de A en plasma no está completamente comprendido (Freeman SH et al., 2007). Los niveles plasmáticos de A probablemente están modulados por el metabolismo y aclaración periféricos y del cerebro, así como el transporte a través del cerebro, LCR y compartimentos vasculares. Aunque todas las

formas cerebrales de A están elevadas en la EA, la débil correlación de diversas

medidas de A cerebral sugiere que pueden reflejar distintos pools bioquímicos y morfológicos (Ingelsson M et al., β004). El equilibrio normal entre A de LCR y plasma puede romperse con el inicio de los depósitos de A en el cerebro (Giedraitis V et al., 2007), pero estos niveles no se correlacionan en la EA (Mehta PD et al., 2001) y los niveles plasmáticos de A 42 se ven considerablemente influenciados por contaminación medicamentosa (Blasko I et al., 2005), en particular por tratamiento con insulina (Kulstad JJ et al., 2006). Los cambios en A 42 plasmático pueden ser un predictor bioquímico de la eficacia del tratamiento con rivastigmina (Sobow T et al., 2007).

Marisol Herrera Rivero | Doctorado en Ciencias Biomédicas 45 Las medidas plasmáticas de A son potencialmente útiles en estudios clínicos como marcadores de los efectos farmacológicos de medicamentos que afectan el procesamiento de APP. Por ejemplo, la reducción de los niveles plasmáticos de A con tratamiento puede confirmar el mecanismo de acción de los medicamentos que inhiben las - o -secretasas que lo producen. No se han encontrado efectos significativos en estatinas, estrógeno, AINEs, antioxidantes o inhibidores de la colinesterasa en los niveles plasmáticos de A (Tokuda T et al., β001; Fukumoto H et al., β00γ). La

lovastatina y el 17 -estradiol reducen los niveles plasmáticos de A en β-3 meses; sin embargo, los cambios relacionados con la medicación no implican necesariamente un beneficio clínico, ya que los niveles de A en plasma se correlacionan muy pobremente con la severidad de la demencia.

Otro marcador propuesto es una molécula para la captación de hierro, la melanotransferrina, también conocida como p97, que se expresa en el endotelio capilar y microglia asociada a placas amiloides en tejido cerebral de Alzheimer (Jefferies WA et al., 1996a). Se ha reportado que la concentración sérica de p97 se eleva en la enfermedad, por lo que podría ser un marcador de ésta (Kennard ML et al., 1996). Se sabe que p97 se co-localiza con el receptor de transferrina en el endotelio capilar del cerebro, lo que sugiere que la proteína p97 soluble podría cruzar la barrera hematoencefálica por interacción con el receptor de transferrina (Rothenberger S et al., 1996). p97 provee una ruta para la captación celular de hierro del citrato-Fe que no requiere transferrina (Jefferies WA et al., 1996b). En LCR, la concentración de la forma soluble de p97 es mayor que en suero (Kennard ML et al., 1996). La elevación de p97 en el cerebro puede resultar en la elevación de su concentración en suero a través de la ruta de LCR.

Otros biomarcadores sanguíneos descritos incluyen isoprostanos (productos de oxidación lipídica) (Pratico D et al., 2000), homocisteína (intermediario metabólico) (Seshadri S et al., 2002), p97 (Feldman H et al., 2001), IL-1, IL-6, antiquimiotripsina-1 (inhibidor de proteasa de fase aguda) (Licastro F et al., 2000), macroglobulina-2 y el factor H del complemento (Hye A et al., 2006). El 24S-hidroxicolesterol del plasma

Marisol Herrera Rivero | Doctorado en Ciencias Biomédicas 46 refleja la homeostasis del colesterol del cerebro más estrechamente que el colesterol total. Sus niveles en LCR y plasma se reducen por tratamiento con estatinas y niacina (Vega GL et al., 2003).

El alelo ApoE 4 se asocia con un incremento del riesgo a padecer Alzheimer, aparición de la enfermedad a menor edad, carga amiloide incrementada y niveles elevados de A en el cerebro (Gomez-Isla T et al., 1996; Mann DM et al., 1997). El genotipo ApoE influye en los niveles de la proteína, el alelo se asocia con menor cantidad de proteína en plasma (Schiele F et al., 2000).

La lipoproteína Lp(a) es una partícula tipo lipoproteína de baja densidad que contiene la apolipoproteína (a) tipo plasminógeno ligada por puentes disulfuro a la apolipoproteína B-100. Niveles altos de Lp(a) se asocian con ateroesclerosis, enfermedad arterial coronaria y enfermedad cerebrovascular (Milionis HJ et al., 2000). Las partículas Lp(a), que también pueden acarrear ApoE, están involucradas en el metabolismo de lipoproteínas en el cerebro (Ramharack R et al., 1996). Los pacientes de Alzheimer tienen niveles séricos más elevados de esta partícula (Solfrizzi V et al., 2002).

La homocisteína es un aminoácido que contiene grupos tioles y está involucrado en el ciclo de la metionina, como producto de la desmetilación de ésta (que puede ser re- metilada en procesos dependientes de vitamina B12 y folatos), y en la vía de trans- sulfatación (en la que es convertida irreversiblemente en cistationa en un proceso dependiente de vitamina B6) (Diaz-Arrastia R, 2000).

Marcadores incrementados de la oxidación de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos y actividades reducidas de enzimas antioxidantes en el cerebro de Alzheimer apoyan un papel del estrés oxidativo en la neurodegeneración (Bonilla E et al., 1999; Butterfield DA et al., 2002). Los antioxidantes en el plasma incluyen al caroteno, licopeno, vitaminas A, C y E, urato y bilirrubina. Tanto la demencia vascular como el Alzheimer están variablemente asociados con niveles plasmáticos o séricos reducidos de vitaminas A, C y E (Zaman Z et al., 1992; Foy CJ et al., 1999).

Marisol Herrera Rivero | Doctorado en Ciencias Biomédicas 47 El daño de radicales libres de proteínas y ácidos grasos poliinsaturados resulta en formas modificadas que pueden medirse en fluidos como marcadores del estado de oxidación. Los isoprostanos se generan de la peroxidación mediada por radicales libres de ácidos grasos poliinsaturados y se elevan en el cerebro en diversas enfermedades, incluyendo el Alzheimer y el mal de Huntington (Greco A et al., 2000). Los isoprostanos en el plasma se elevan también en otras enfermedades asociadas al estrés oxidativo; se modifican por tratamiento antioxidante (Teunissen CE et al., 2002). El 4- hidroxinonenal, otro producto de la peroxidación lipídica, también se incrementa en plasma en el Alzheimer (McGrath LT et al., 2001).

Los depósitos amiloides en el cerebro de Alzheimer provocan diversas respuestas inflamatorias que incluyen astrocitosis, microgliosis, incremento de citocinas proinflamatorias, activación del complemento y reacciones de fase aguda (Weiner HL y Selkoe DJ, 2002). Las moléculas inflamatorias que incrementan variablemente en la enfermedad incluyen la CRP, IL-1, TNF-, IL-6 y su complejo receptor, antiquimiotripsina-1 y TGF-, así como quizá IL-12 y los interferones - y - (Teunissen CE et al., 2002).

La enzima glucógeno sintasa cinasa 3 (GSK3) se eleva en las células blancas circulantes en la periferia en el Alzheimer (Hye A et al., 2005). La actividad incrementada de BACE1 y el incremento en la expresión de la monoamino oxidasa (MAO) B en las plaquetas y el cerebro de pacientes con demencia se ha confirmado repetidamente (Adolfsson R et al., 1980); también se ha detectado un incremento en la actividad de la fosfolipasa-A2 en las plaquetas de pacientes con Alzheimer (Krzystanek E et al., 2007).

Entre los cambios en las plaquetas, se ha sugerido que las anormalidades en APP pueden predecir la conversión del DCL a demencia de tipo Alzheimer (Borroni B et al., 2003) y se han correlacionado con la fluidez de membrana y el declive cognitivo (Zainaghi IA et al., 2007). En plaquetas, el APP intacto de 150 kDa es procesado en dos formas truncadas de 120-130 kDa y 110 kDa. Se han reportado alteraciones en los índices de isoformas de APP en las plaquetas, de las formas de alto peso molecular a

Marisol Herrera Rivero | Doctorado en Ciencias Biomédicas 48 las de bajo peso molecular, en la EA y el DCL (Padovani A et al., 2002) pero no en otras demencias. La reducción en el índice de isoformas de APP se correlaciona con la severidad y progreso de la enfermedad (Baskin F et al., 2000). La reducción del colesterol, niacina, simvastatina e inhibidores de la colinesterasa corrigen los anormalmente bajos índices de isoformas de APP en los casos de Alzheimer (Borroni B et al., 2001; Baskin F et al., 2003). Estos índices son independientes del sexo o genotipo de ApoE (Rosenberg RN et al., 1997).

Alteraciones en la función celular implicadas en la EA también se observan en células periféricas, incluyendo los linfocitos, lo que hace a estas células una herramienta potencial en la investigación de la patogénesis de la enfermedad (Mattson MP, 2002). Los linfocitos muestran defectos similares a las neuronas en la EA, por lo que han mostrado ser un modelo celular adecuado para estudiar los cambios patológicos en la enfermedad. Se cree que los cambios específicos en el Alzheimer elevan la susceptibilidad en los linfocitos T. La gran ventaja de los linfocitos como modelo periférico en comparación con el LCR es la separación no invasiva, barata y rápida. Así, los linfocitos pueden ser un modelo celular aplicable para encontrar un biomarcador válido y fácilmente detectable para la enfermedad de Alzheimer (Leuner K et al., 2007).

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J

La investigación de biomarcadores para el Alzheimer se ha fortalecido en años recientes debido a las implicaciones que un diagnóstico temprano y certero tendría sobre el progreso de la enfermedad. Un marcador sanguíneo representa una prueba de bajo costo y fácil acceso, por lo que gran cantidad de moléculas están siendo investigadas en la sangre de pacientes con EA. Recientemente, estudios realizados en células leucocitarias han demostrado que patrones específicos para el Alzheimer, en comparación con individuos cognitivamente sanos, pueden ser identificados. Para este trabajo nos interesamos en analizar variables clínicas asociadas con riesgo a padecer la EA, así como los genes de tau, APP, nicastrina, -secretasa, genes cruciales en la fisiopatología del Alzheimer, y genes que se relacionan con ellos mediante la interacción de sus productos, o bien compartiendo características similares, ésto con la intención de investigar su posible utilización en la generación de herramientas que ayuden al diagnóstico diferencial de la EA.

Hasta donde nuestro conocimiento abarca, el enfoque de este estudio es diferente a estudios que se han realizado por otros grupos de investigación hasta el momento ya que, en lugar de centrarnos en aquellos genes que han mostrado variar significativamente en la EA, en comparación con grupos control, investigamos genes que son clave para la patología neuronal y aquéllos que se asocian con ellos, aunque no compartan las mismas vías. Aportamos, por tanto, un enfoque distinto para la generación de clasificadores de enfermedad, no tan sólo para la EA, sino para una diversidad de desórdenes de similar complejidad.

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