tejido derivado de craniectomía decompresiva
3.1 Antecedentes
En los dos primeros capítulos de este documento, hemos mostrado varios hallazgos histológicos importantes en el estudio del tejido contuso extraído por cirugía decompresiva en humanos que han sufrido un TCE severo: 1. El compromiso tisular dentro del tejido contuso no es homogéneo entre poblaciones celulares ni entre subpoblaciones neuronales; 2. En el componente neuronal se aprecian grados de alteración de la citoarquitectura cortical que se intercalan; 3. Estos grados de alteración podrían sugerir porciones microscópicas de tejido con daño irreversible (zonas de parche) y otras con posibilidades de sobrevivencia y recuperación in situ (zonas con citoarquitectura conservada); 4. La pérdida total de la inmunorreactividad para NeuN en los sectores de parche (dentro de la contusión) podría significar pérdida neuronal; 5. Aún en los sectores de
64 citoarquitectura conservada, algunas neuronas se aprecian con alteraciones morfológicas.
A partir de estos hallazgos, surgieron nuevos interrogantes acerca de lo que podría ser el destino final del tejido contuso de continuar in situ, ya que el principal propósito del manejo médico en los pacientes que sobreviven al TCE severo es la prevención y la mitigación de la lesión secundaria, la cual puede perpetuarse por meses o incluso años, y ser la responsable de buena parte de las secuelas neurológicas, psiquiátricas y comportamentales. Las medidas básicas que los servicios de neurocirugía han implementado con estos pacientes son el monitoreo complejo y terapia médica avanzada y/o control de la presión intracraneana por evacuación de la lesión que genera el efecto de masa a través de la cirugía decompresiva (Chieregato & Fainardi, 2008). La pregunta de fondo es: ¿Es viable el tejido contuso extraído quirúrgicamente? Hasta el momento hemos corroborado que definitivamente algunos sectores (identificados microscópicamente) no podrían serlo, pero ¿cuáles son las consecuencias para aquellos sectores con organización laminar “preservada”, de continuar en ese escenario adverso que propone el tejido que definitivamente no es viable? ¿Es realmente viable el tejido identificado como “con citoarquitectura conservada”?
Los estudios sobre los accidentes cerebrovasculares como la isquemia cerebral, han sido los que tradicionalmente procuran identificar el tejido lesionado viable. Es ampliamente reconocido que en la isquemia, es posible identificar una región de foco y otra de penumbra; esta última es considerada como una región morfológicamente preservada y susceptible de recuperación fisiológica (Astrup et al., 1981; Hakim, 1987; Hossmann, 1994). Infortunadamente, en el trauma craneoencefálico este reconocimiento no ha sido posible histológicamente, a pesar de los esfuerzos y de las implicaciones terapéuticas que tendría.
Aunque existe gran cantidad de estudios sobre los cambios histopatológicos en las muestras contusas de humanos (Bullock et al., 1991; Clark et al., 1999; Graham et
65 al., 2002; Løberg & Torvik, 1989; Oehmichen & Raff, 1980; Ribas & Jane, 1992; Seidberg et al., 2003; L. Zhang et al., 2006; Xiaopeng Zhang et al., 2003), estos son realizados en tejido post-mortem con varios años de sobrevida, con técnicas histológicas convencionales o de ultraestructura, sin contemplar el análisis de la organización estructural del tejido o haciéndolo en periodos crónicos del evento lesivo.
Por lo tanto, en este último capítulo se presenta un análisis del tejido contuso realizado en las mismas muestras empleadas en los dos primeros apartados del documento, haciendo énfasis en el componente neuronal y la valoración del estado de viabilidad o degeneración del mismo, específicamente en los sectores de citoarquitectura conservada identificados previamente.
Para tal propósito, nos hicimos las siguientes preguntas específicas:
- ¿Es la disminución de la IR para NeuN en el tejido contuso de humano, una pérdida de la antigenicidad o una disminución de la proteína propiamente? - ¿Cuál es la proporción de neuronas, en los sectores de citoarquitectura
conservada, que exhiben una apariencia de normalidad en su estructura celular?
- ¿Coinciden los sectores de parche de pérdida de la IR para NeuN con sectores de pérdida celular observados con la tinción de Nissl?
- ¿En qué sectores del tejido contuso se pueden identificar neuronas en proceso de degeneración? ¿Coinciden estos sectores con los de citoarquitectura conservada o con los de parche de pérdida de la IR para NeuN?
Para dar respuesta a las preguntas anteriores, inicialmente calificamos la calidad de la marcación (célula a célula) de las neuronas NeuN-positivas en los sectores de citoarquitectura conservada del tejido contuso y la comparamos con la del tejido post-mortem. También comparamos la ubicación de los parches de la
66 marcación de NeuN con cortes consecutivos procesados con la tinción de Nissl; cuantificamos la proteína NeuN a través de la técnica de Western Blot; y por último, procesamos tejido contuso con el marcador Fluoro-Jade C, que marca específicamente neuronas en degeneración (Schmued, Albertson, & Jr, 1997) para compararlo con los cortes ya procesados para NeuN. Este último marcador mencionado, ha sido ampliamente utilizado en modelos animales con diferentes tipos de lesión cerebral (K. Anderson et al., 2005; Castro et al., 2011; Collombet et al., 2006; Dennis et al., 2009; Hall et al., 2008; F. Liu et al., 2009; Sato et al., 2001; Singleton & Povlishock, 2004), pero hasta el momento no se ha empleado para valorar neurodegeneración celular en tejido cerebral de humano con TCE.
3.2 Materiales y Métodos
Este estudio también hizo parte del macroproyecto de investigación denominado “Estudio cualitativo y cuantitativo del trauma craneoencefálico en humanos”, financiado por Colciencias (Código No. 1106-04-16329). Por esta razón, las muestras de tejido con TCE y las de los controles post-mortem de este apartado corresponden a las del capítulo anterior, conservando los mismos criterios de inclusión y exclusión para ambos grupos de muestras. Los procedimientos para el procesamiento histológico de las muestras en el estudio actual, incluyen aquellos descritos en el primer capítulo 1. Adicionalmente, se describirán algunos hasta ahora no mencionados y en los cuales se hará énfasis.
3.2.1 Los pacientes con TCE y las muestras de tejido contuso
Para responder a las preguntas del presente capítulo, se analizaron muestras de tejido cerebral contuso, provenientes de 12 pacientes (ver Tabla 6) con diagnóstico de contusión cerebral focal y con hipertensión endocraneana severa.
67 En ningún caso se hizo remoción adicional de tejido cerebral para efectos del presente estudio. Todos los procedimientos para la recolección de las muestras y su posterior análisis, fueron aprobados por los Comités de Ética del Hospital Universitario del Valle y de la Facultad de Salud de la Universidad del Valle (Acta No. 045, de 2004).
Tabla 6. Características de los pacientes con TCE para el estudio 3 Muestra Sexo Edad GI GOS Lóbulo Hem TPT HN
T07 M 22 12 5 Fron Der 3 HSDA, HP, HSF T08 M 28 13 5 Fron Izq 3 BDP, II par
T09 M 30 14 5 Fron Izq 2 HSF
T10 M 35 10 1 Fron Izq 3 DAI, II par
T11 M 7 13 5 Temp Izq 3 AF
T12 M 53 5 1 Temp Der 1 HSDA, HSF, HU
T13 M 48 13 5 Fron Izq 4 HSDA
T14 M 42 8 5 Temp Izq 2 HSDA, HSF, HU, AF, HP, III par
T16 F 72 13 5 Fron Izq 3 -
T17 M 22 14 5 Temp Izq 4 HSDA
T18 F 4 11 3 P-O Der 2 HSDA
T19 F 39 11 3 Temp Izq 2 HSDA, AF, NH GI: Glasgow de Ingreso al servicio de urgencias; GOS: Glasgow Outcome Score; Temp: Lóbulo Temporal; Fron: Lóbulo Frontal; P-O: Transición parieto-occipital; Hem: Hemisferio; Der: Derecho; Izq: Izquierdo; TPT: Tiempo entre el trauma y la cirugía (en días); HN: Otros hallazgos neurológicos adicionales a la contusión; HSDA: Hemorragia Subdural Aguda; HSA: Hemorragia Subaracnoidea; HP: Hemiparesia; HU: Herniación Uncal; AF: Afasia; HSF: Herniación Subfalcina; BDP: Bradipsiquia; II par: compromiso del II par craneal; III par: compromiso del III par craneal; NH: Nistagmos Horizontal; DAI: Lesión Axonal Difusa.
3.2.2 Los sujetos control y las muestras de tejido sin TCE
La expresión histológica y la cuantificación de los marcadores de interés en el tejido contuso fueron comparadas con la expresión y cuantificación de los mismos en tejido post-mortem sin TCE. Las muestras control de este apartado fueron las
68 mismas que se emplearon en capítulo 2 (ver Tabla 5, pág. 41) obtenidas en el Instituto de Medicina Legal y Ciencias Forenses de Cali.
3.2.3 Procesamiento de las muestras
Todos los procedimientos descritos a continuación, se realizaron en condiciones estándar de laboratorio, tanto para las muestras post-mortem como para las muestras contusas. Para mayor detalle del procesamiento, remitirse al apartado 1.2.3 del capítulo 1 de este documento.
En la Tabla 7 se especifica las técnicas a las que fueron sometidas cada una de las muestras con TCE del presente estudio, ya que las limitaciones de tejido en algunas de ellas impidieron someter todas las 12 muestras a todos los procedimientos.
Es de mencionar, que como parte del protocolo de procesamiento de cualquier muestra de tejido cerebral que llega a nuestro laboratorio dentro del macroproyecto, antes de iniciar la fijación en PLP, también se extraían pequeñas muestras (de 27 mm3) y se almacenan a -70º C para posibles análisis bioquímicos como la cuantificación de proteínas por Western Blot; y en el momento de realizar los cortes seriados que se procesarían para inmunohistoquímica, simultáneamente se cortaba una tajada que se incluía en parafina para realizar cortes más delgados y procesarlos con técnicas de histoquímica como la tinción clásica de Nissl y la histofluorescencia de Fluoro-Jade C (FJC). De aquí se obtendrían los cortes que posteriormente serían comparados con aquellos inmunomarcados para NeuN. El protocolo descrito para el registro fotográfico de NeuN en los capítulos anteriores, fue el mismo empleado en el presente estudio para el registro de los cortes con la tinción de Nissl.
69 Tabla 7. Técnicas aplicadas a cada muestra de tejido contuso
Muestra NeuN-IHQ NeuN-Nissl FJC WB
T07 X X X T08 X X T09 X X X X T10 X X X X T11 X T12 X X T13 X X X T14 X X X X T16 X X X X T17 X X X X T18 X X X T19 X
NeuN-IHQ: muestra sometida al análisis de la calidad de la expresión histológica de NeuN; NeuN-Nissl: muestra procesada por inmunohistoquímica para NeuN y también con la tinción de Nissl; FJC: muestra procesada por histofluorescencia con Fluoro-Jade C; WB: muestra procesada por Western Blot contra NeuN.
La calificación del nivel de expresión de NeuN en las células inmunomarcadas, se llevó a cabo en los cortes histológicos de 10 de las muestras procesadas (ver Tabla 7) para los estudios del primer y segundo capítulo, por lo cual se omitirá la descripción del proceso inmunohistoquímico en este apartado. Este análisis se hizo empleando las imágenes capturadas con los objetivos de 4x, 10x y 40x, mencionadas en los dos capítulos anteriores.
3.2.4 Análisis de la calidad de la expresión histológica de NeuN
Como se mencionó en los capítulos anteriores, en el tejido contuso se encontraron al menos dos tipos de sectores de acuerdo con el grado de compromiso frente a la lesión: las zonas de citoarquitectura conservada y las zonas de parche de pérdida
70 significativa de la IR para NeuN. No obstante, la medida precisa del área ocupada por cada tipo de sector no había sido determinada hasta ahora. La forma de realizar esta medición fue descrita en el capítulo 1, pero el análisis cuantitativo con las 12 muestras de tejido contuso será presentado en el presente estudio.
Si bien en los sectores de preservación laminar se había observado una aparente o leve diferencia en la densidad celular respecto del tejido control, la corroboración cuantitativa de esta diferencia también estaba pendiente de llevarse a cabo. La cuantificación de las neuronas NeuN-positivas se hizo en cajas de conteo (de 300 m de ancho x 150 m de profundidad), ubicadas en la transición entre las láminas II y III y entre las láminas V y VI. En los sectores de parche no se realizaron cuantificaciones celulares por la obvia disminución de la densidad.
La aparente “normalidad” en los sectores de citoarquitectura conservada del tejido contuso, dejaba de serlo al observarse en imágenes de alta magnificación, donde se apreciaron neuronas con patrones diversos en la calidad de la marcación para NeuN, respecto de lo reportado como normal en la literatura (Gittins & Harrison, 2004; Robertson et al., 2006). Con el fin de cuantificar la alteración del patrón de expresión de NeuN en los sectores de citoarquitectura conservada, fue necesario distinguir dos tipos de poblaciones de neuronas marcadas para NeuN: 1. Cualquier soma visto en el mejor plano focal del corte analizado sería denominado “neurona positiva para NeuN” (NeuN+); 2. Cualquier soma que cumpliera con las características del patrón de marcación normal de una neurona con NeuN, se denominaría una “neurona NeuN-positiva normal” (NeuN-N). Dicho patrón normal consistía en una marcación uniforme, fuerte y claramente compartimentalizada, siendo más intensa en el núcleo y un poco más leve en el citoplasma del soma y de las dendritas proximales (según (Robertson et al., 2006). La segunda población representa una subpoblación de la primera, por eso, la proporción de la segunda respecto de la primera, nos daría el porcentaje de células normalmente inmunorreactivas en el tejido. Estas poblaciones fueron contadas de manera
71 aislada por dos observadores independientes y debidamente entrenados. Los conteos de estas poblaciones se hicieron en las mismas cajas de conteo mencionadas en el párrafo anterior, ubicando una caja por lámina y por cada corte (3 cortes por muestra). Luego se combinaron los conteos de las seis láminas corticales para obtener un número total de neuronas por columna cortical completa. La proporción de neuronas normalmente marcadas se obtuvo de la razón NeuN-N/NeuN+.
Todo el análisis de la calidad de la expresión celular de NeuN, se hizo con la asistencia del programa Sigma ScanPro 5 (SPSS, Chicago, Illinois, USA).
3.2.5 Tinción de Nissl
Los cortes de 6 m de espesor hechos en micrótomo, en el sentido tangencial del tejido, fueron puestos en láminas portaobjetos gelatinizadas. Una vez secos, se desparafinizaron por inmersión en xilol 3 veces (2 minutos cada vez) y se sometieron a una batería de soluciones en el orden y los tiempos especificados a continuación: alcohol de 100% (2 veces por 3 minutos cada vez), alcohol de 95% (2 veces por 10 y 2 minutos respectivamente), la solución de Cloroformo al 80% por 15 minutos, nuevamente alcoholes de 95% y 100%, 2 minutos cada uno; se sumergen en xilol por 5 minutos, alcohol de 100% por 2 minutos, alcohol de 95% (2 veces por 2 minutos cada una), agua destilada por 2 minutos, solución de Violeta de Cresyl al 5% por 15 minutos, inmersión rápida en alcohol de 70% con 10 gotas de ácido acético glacial; alcohol de 90% por 1 minuto, alcohol de 100% (3 veces por 3 minutos cada uno), y finalmente, xilol (2 veces por 3 minutos).
3.2.6 Western Blot de NeuN
Para llevar a cabo la cuantificación de la proteína NeuN, se utilizó el análisis bioquímico por electroforesis, electrotransferencia e inmunoblot. El procedimiento
72 descrito a continuación fue exactamente igual para 3 muestras control y 7 con TCE. Se emplearon aproximadamente 27 mm3 (30 mg) de tejido que fueron inicialmente inmersas en 700 L de buffer RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 1 mM EDTA; Tritón X-100 al 0,5%; SDS al 0,5%; ácido deoxicólico al 0,5%) e inhibidor de proteasas (Aprotinina de pulmón bovino A6279, Sigma, St. Louis, MO, USA). Luego, se sonificaron las muestras usando un dispositivo ultrasónico (Branson Ultrasonic Corporation 2510, Danbury, CT, USA) por 10 minutos, y subsiguientemente se homogenizaron. Ya homogenizadas, se centrifugaron a 14.000 rpm por 20 minutos a 4º C. Los sobrenadantes fueron congelados a -20º C hasta su uso. La concentración de proteínas en los sobrenadantes de estas muestras se determinó por el método de Bradford; preparándose para obtener una concentración final de 45 g de proteína por pozo en geles de SDS-PAGE al 10%. Después de la separación de las proteínas por electroforesis, las electrotransferimos a membranas de PVDF. Estas membranas se sometieron luego al inmunoblot, así: inicialmente se sumergieron en una solución de bloqueo (Tris-Base al 0,08%; NaCl al 0,9%; Tween 20 al 0,3% y BSA al 0,3%) por una hora; luego fueron incubadas en el anticuerpo primario (Mouse Anti-Neuronal Nuclei Monoclonal Antibody, Chemicon International-MAB377, Temecula, CA, USA) diluido 1:2500 en TBS. Después se lavaron las membranas 3 veces en TBS y se incubaron en suero del complejo Biotina/Avidina (Vectastain Elite ABC, PK- 6102 Mouse IgG, Vector Laboratories, Southfield, Michigan, USA) diluido 1:200 en TBS durante 1 hora cada uno. Finalmente se revelaron las membranas usando una solución que contenía Diaminobencidina al 4%, peróxido de hidrógeno al 2% y níquel al 2% diluidos en PBS (Peroxidase Substrate Kit, DAB SK-4100, Vector Laboratories, Southfield, Michigan, USA). Como control negativo del procedimiento, una membrana fue procesada de la manera arriba descrita pero omitiendo agregar el anticuerpo primario. El anticuerpo contra III-Tubulina (Anti- βIII Tubulin monoclonal antibody, G7121, Promega, Madison, WI, USA) diluido 1:5000, fue utilizado como un estándar interno. Todo este procedimiento fue llevado a cabo por duplicado.
73 El Western Blot para NeuN permitió reconocer las bandas características de NeuN: 2 bandas tenues de 46 y 48 kDa, una banda de 66 kDa y 2 bandas densas de 92 y 96 kDa. Estas últimas, corresponden a las formas diméricas de las bandas de 46 y 48 kDa, respectivamente. Las bandas de 92 y 96 kDa fueron las que siempre se marcaron en todos los procedimientos realizados de todas las muestras contusas y control; además, migraron una respecto de la otra con muy baja resolución o definición, por lo tanto, solo se analizaron estas y en forma conjunta, tal como ya lo habían hecho otros autores (Collombet et al., 2006). El anticuerpo Anti-III-Tubulina marcó una única banda de 50 kDa, en forma densa, intensa y aparentemente homogénea para todas las muestras. Con la asistencia del programa Gel Pro Analyzer 4.5 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA), cuantificamos la densidad óptica de las bandas de 92 y 96 kDa de NeuN y la banda de III-Tubulina de 50 kDa, para determinar si habían variaciones en la proporción NeuN/III-Tubulina entre las muestras control y con TCE.
3.2.7 Histofluorescencia para Fluoro-Jade C
Para identificar las neuronas en degeneración, utilizamos secciones de 6 m de espesor, cortadas con micrótomo, a partir del tejido embebido en parafina y puestas en láminas portaobjetos gelatinizadas. Estos cortes se desparafinizaron con xilol por 12 horas, se rehidrataron y sumergieron en etanol absoluto por 3 minutos seguido de etanol al 70% por 1 minuto y un lavado con agua destilada por 2 minutos. Luego se transfirieron los portaobjetos a una solución de Permanganato de Potasio (KMnO4) al 0,06% durante 15 minutos y lavadas en agua destilada 3 veces por 1 minuto cada una. Después se sumergieron en la solución de Fluoro-Jade C (Fluorojade C, Chemicon International-MAB377, Temecula, CA, USA) al 0,0001% durante 30 minutos, y lavados 3 veces por 1 minuto con agua destilada. Una vez secas completamente las secciones, se
74 sumergen en xilol por 1 minuto, se les aplicó un medio de montaje y se les puso cubreobjetos.
Para realizar las capturas fotográficas de esta tinción, los cortes fueron analizados con el microscopio de confocal Leica TCS SP5 (Leica Micro-systems, Mannheim, Germany). Las imágenes de confocal de un plano óptico simple (con 1 m de grosor) fueron obtenidas usando una longitud de onda de emisión de 525 nm. El laser de argón-criptón fue usado para excitar al fluorocromo a 488 nm. La atenuación del láser, el diámetro del pinhole, la sensibilidad del fotomultiplicador y la compensación fueron características constantes en la captura de las imágenes de todas las muestras.
La valoración cuantitativa de FJC se llevó a cabo en los cortes de corteza cerebral (en tres cortes por muestra) que se detectaron como consecutivos de aquellos procesados por inmunohistoquímica para NeuN. Las imágenes analizadas fueron tomadas usando una magnificación de 5x, en las cuales se identificó morfológicamente la sustancia gris usando un microscopio acoplado al programa
ImageJ (National Institute Health, USA). Ubicadas las regiones de interés, por superposición de las imágenes de NeuN y FJC, se colocó una cuadrícula de 1 mm2 de área, dentro de zonas con parche y dentro de zonas con citoarquitectura conservada, en las cuales se llevaron a cabo los conteos de las células FJC- positivas. Estas células debían tener marcado el núcleo y el citoplasma somático de forma intensa y homogénea. Así, se obtuvo el valor de la densidad de las neuronas FJC-positivas en el área indicada.
3.2.8 Presentación y análisis de los datos
Se mostrarán los porcentajes promedio de tejido con zonas de parche y con zonas de citoarquitectura preservada en las muestras contusas. Todos los conteos de