Implications for practice

La tecnología seleccionada para el análisis fue, de nuevo, la qPCR aunque en esta ocasión la cuantificación debe realizarse durante la fase exponencial de la reacción, puesto que proporciona los datos más precisos para la cuantificación. Para poder realizar las mediciones en la fase exponencial, se calculan dos valores:

• Umbral: El nivel de intensidad de fluorescencia mínima generada por la reacción al que se considera fruto de la amplificación específica y no ruido de fondo o amplificaciones inespecíficas derivadas del exceso inicial de reactivos presentes en la mezcla de reacción. Debe definirse por encima del ruido de fondo y siempre al principio de la fase exponencial.

• Ct (Cycle threshold): Es el ciclo de la reacción de qPCR en el que la muestra alcanza el umbral. Su valor es inversamente proporcional a la cantidad de copias del ARNm diana iniciales, puesto que cuantas más copias iniciales haya en la muestra menos ciclos de amplificación se necesitan para alcanzar la intensidad de fluorescencia umbral y viceversa.

La tecnología fluorescente utilizada también fueron las sondas de hidrólisis Taqman® MGB (Figura 13). A diferencia de la técnica diseñada para el genotipado, en esta ocasión sólo existe en la reacción una sonda marcada con el fluoróforo FAM™ en 5’ y con un complejo NFQ-MGB en 3’. Al conjunto de los cebadores específicos para la amplificación del ARNm en cuestión y la sonda complementaria al centro de este amplicón, se le conoce como ensayo. Los ensayos fueron seleccionados del panel de ensayos disponibles en Applied Biosystems en función de los siguientes criterios:

84 - Que el ensayo amplifique el mayor número de secuencias posibles (RefSeq) del ARNm en cuestión.

- Un tamaño de amplicón de entre 60 y 90 pb: el límite inferior es prudente a la hora de asegurar la especificidad de la amplificación y la disponibilidad de suficiente secuencia para la selección de una sonda que cumpla todas las características buscadas. El límite superior es debido a la procedencia de nuestras muestras de material FFPE. Dada la gran degradación a la que ha sido expuesto el ARN de nuestras muestras la selección de amplicones más largos disminuiría el número de moléculas íntegras para amplificar.

- Que en el diseño del ensayo la sonda incluya en su secuencia parte de 2 exones. Esto asegura que no sea posible la detección de la amplificación de ADN genómico.

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Figura 13: Representación de la reacción de PCR cuantitativa a tiempo real con

sondas de hidrólisis Taqman®. Imagen tomada de “Introduction to Quantitative PCR. Methods and Applications Guide” Agilent Technologies, 2010. En la fase de hibridación los cebadores y la sonda hibridan con sus secuencias complementarias. Durante la fase de polimerización la polimerasa se encuentra con la sonda y escinde nucleótido a nucleótido para poder continuar con su labor. Como resultado el fluoróforo se separa del quencher y comienza la emisión de fluorescencia.

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GEN ENSAYO SECUENCIA AMPLICÓN

EGFR Hs01076091_m1 NM_005228.3 CCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCC CGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAA TTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACA MED1 Hs01062349_m1 NM_004774.3 TGGTCAGCTGTTTGGAGACATTGCAG AAGGCTCTCAAAGTAACATCTTTACCA GCAATGACTGATCGT FOXA1 Hs00270129_m1 AK313785.1 ACCAGCGACTGGAACAGCTACTACGCA GACACGCAGGAGGCCTACTCCTCCGTCC CGGTCAGCAACATGAACTC IGF1R Hs00951562_m1 NM_000875.3 TGCATGGTAGCCGAAGATTTCACAGTC AAAATCGGAGATTTTGGTATGACGCGA GATATCTATGAGACAGACTATTACCGG c-Src Hs01062585_m1 NM_004383.2 GACGAGGAGGTGTACTTTGAGAACCTC ATGCAGCTGGTGGAGCACTACACCTCA GACGCAGATGGACTCTGTACGCGC

Tabla 3: Información sobre los ensayos prediseñados de Applied Biosystems para

la cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados. Se indican: el nombre del ensayo, la secuencia tomada como referencia para la obtención de la información referida al amplicón y la secuencia del amplicón. El amplicón comprende la secuencia incluida entre los dos cebadores y la suya propia en la hebra molde (5’3’).

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GEN ENSAYO SECUENCIA AMPLICÓN

ESR1 Hs01046818_m1 NM_000125.3 CCCAGCTCCTCCTCATCCTC TCCCACATCAGGCACATGAGTAACAAA GGCATGGAGCATCTGTACAG PUM1 Hs00982765_m1 NM_014676.2 TTTGGACAAGGTCTGGCAGCAGGCA TGCCAGGTTATCCGGTGTTGGCTCC TGCTGCTTACTATGACCA GUSB Hs99999908_m1 NM_000181.3 TCATTTGGAATTTTGCCGATTTCATGAC TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGGG GAATAAAAAGGGGATCTTCACTCGGC

Tabla 3 (Continuación): Información sobre los ensayos prediseñados de Applied

Biosystems para la cuantificación de la expresión génica de los genes estudiados. Se indican: el nombre del ensayo, la secuencia tomada como referencia para la obtención de la información referida al amplicón y la secuencia del amplicón. El amplicón comprende la secuencia incluida entre los dos cebadores y la suya propia en la hebra molde (5’3’).

Las qPCR fueron realizadas por duplicado según el Protocolo 8 en un Real Time PCR System 7500 Fast (Applied Biosystems). Se seleccionaron los genes endógenos GUSB y PUM1 a partir de la literatura, por su expresión altamente estable en el tejido mamario tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. El análisis de estos genes sirve para poder normalizar la expresión de los genes diana, de forma que el resultado se independiza de variables como la cantidad de ARN total puesto en la reacción, que podrían llevar a error a la hora de comparar entre distintas muestras.

88 A pesar de que los ensayos Taqman® de Applied Biosystems están probados y garantizan una eficiencia del 100%±10%, dada la procedencia de nuestras muestras de ARN y la gran exposición a la degradación que han sufrido durante el tratamiento FFPE, se realizó la puesta a punto de los ensayos escogidos (Protocolo 8A). A partir de mezclar 500 ng de ADNc de 10 muestras de tejido FFPE extraído y retrotranscrito siguiendo los mismos protocolos se creó una muestra estándar de concentración conocida que representaba todas las condiciones presentes en nuestras muestras problema. Se realizaron 6 diluciones seriadas de esta muestra estándar que fueron analizadas con cada uno de los ensayos. Con los resultados obtenidos se realizaron las curvas patrón necesarias para el cálculo de la eficiencia de amplificación de los ensayos seleccionados siguiendo las instrucciones del manual Amplification Efficiency of Taqman® Gene Expression Assays de Applied Biosystems. La eficiencia de los ensayos de los genes endógenos y los genes diana fueron similares (con una diferencia inferior al 10%): los valores de R2 para todas las curvas de calibración generadas fueron superiores a 0,99 y todas las eficiencias de ensayos Taqman® fueron superiores al 90%. Se cumplieron, por tanto, todas las condiciones exigibles para poder realizar el análisis según el Método ddCt (User Bulletin #2, Applied Biosystems; (305)). Este método consiste en una cuantificación relativa de los genes diana (306). El Ct de cada muestra para el gen diana se normaliza con el Ct de la misma para el gen endógeno, dando como resultado el valor dCt. En un segundo análisis se enfrentan los dCt de las muestras problema con el dCt de la muestra de referencia o calibrador, dando como resultado el valor ddCt. Para obtener el valor de cuantificación relativa (RQ) se debe aplicar este valor a la fórmula RQ=2^-ddCt, lo que nos da los valores de cambio relativo, medidos en unidades de fold change (FC).

89 Se realizaron controles RT-minus para cada ensayo tomando como muestra ADN humano total comercial (Roche®) para garantizar que no se detectaba la amplificación de ADN genómico. Se analizó un control negativo de cada serie de retrotranscripciones realizadas para descartar contaminaciones en este paso. Así mismo se incluyeron otros controles en cada placa de qPCR:

- controles negativos para cada ensayo para descartar la contaminación de las mezclas de reacción de qPCR,

- un control positivo tomando como muestra ARN total humano de mama comercial (Human Breast Total RNA, Ambion®) para descartar que la eficiencia de la qPCR variase entre placas.

Las muestras sanas fueron evaluadas por separado siguiendo estrictamente los mismos protocolos que las muestras problema. Una vez comprobado que las diferencias estadísticas entre ellas no eran significativas, se unieron formando un pool que fue analizado del mismo modo para obtener los valores de referencia para cada gen, constituyendo el calibrador en nuestro método ddCt.

Se realizó el análisis de la fluorescencia final generada para cada muestra mediante el software SDS y en caso de que la desviación estándar obtenida entre los duplicados fuese mayor de 0,35 se reanalizó la muestra. Se evaluaron los controles de forma que:

- para los controles negativos sólo se aceptaron resultados de “no amplificación” (Undeterminate),

90 - se analizaron los distintos análisis en cada placa del control positivo, descartándose desviaciones estándar superiores a 1 Ct entre las distintas mediciones de cada ensayo.

Una vez hechos los experimentos para todas las muestras y el calibrador, y evaluados todos los controles, se realizó un estudio que incluía todos los experimentos en el que se establecieron las líneas basales y las fluorescencias umbrales para cada gen. Los resultados se corrigieron en función de las eficiencias calculadas previamente para cada ensayo. Se definieron como controles endógenos los genes PUM1 y GUSB y como muestra de referencia el calibrador. El software corrige las fluorescencias generadas en función de la eficiencia dada para cada ensayo y aporta un dato de Ct para cada pocillo. Realiza los cálculos referidos al método ddCt con el Ct medio de los duplicados y aporta los datos de RQ y un intervalo de confianza del 95% (RQmin-RQmax). Los datos de RQ se representan en un gráfico de barras tomando la expresión del calibrador como valor 1 (Figura 14).

Los niveles de RQ expresados en valores de FC, representan el cambio de expresión sufrido en una muestra patológica frente a los niveles considerados como fisiológicos (RQ=1FC). De esta forma, se considera que valores de RQ ≤0,5 FC indican una represión de la transcripción del gen en cuestión, mientras que valores de RQ ≥2FC indican una sobreexpresión génica. Sin embargo, hay que tener en cuenta que no siempre estas alteraciones en los niveles de expresión génica, es decir, de transcripción a ARNm, se ven trasladados al nivel de proteína, ya sea por factores reguladores postranscripcionales como la acción de los microARNs, por la estabilidad de las moléculas de ARN, intrínseca a su propia naturaleza y a su secuencia, o por factores reguladores de la traducción y modificaciones postraduccionales que determinan en gran medida los valores finales de proteína funcional. En base a estas consideraciones,

91 las variables moleculares de expresión génica fueron categorizadas como expresión reprimida (RQ≤0,5FC), similar a la fisiológica (0,5FC<RQ<1,5FC) o sobreexpresión (RQ≥1,5FC). Estos son los rangos que actualmente se consideran en la práctica de la genética clínica. Sin embargo, para facilitar el análisis estadístico, en algunos análisis estas 3 categorías se agruparon en 2, de forma que hablamos de sobreexpresión frente a normal o reprimido o bien de represión frente a normal o sobreexpresado en función de las características del gen en cuestión.

Figura 14: Ejemplo de representación gráfica de los niveles de cuantificación

relativa de la expresión génica (RQ del inglés Relative Quantification) generada mediante el método ddCt. El calibrador de mama normal (CMN) establece el nivel de expresión normal correspondiéndose con un RQ=1. En comparación con él, se relativizan las expresiones génicas del resto de muestras (NTC= “not template control” o control negativo).

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