Durante el seguimiento se perdieron 29 pacientes y se informaron éxitus del 25% (47/191) de las pacientes. En nuestra serie no encontramos diferencias en la SG en función del fenotipo (Figura 34).
Figura 34: Curvas de Kaplan-Meier para la SG en función del fenotipo.
A continuación se describen las variables que demostraron influencia sobre la SG en la serie completa (tabla 31) y en función del subtipo (tablas 32 y 33).
Luminal A: 161 (153-169) Luminal B: 151 (140-162) Test Log Rank, p=0,644 HR= 0,87 (0,48-1,57)
152 TODOS N Media IC (95%) p Log Rank Edad ≥50 años <50 años 140 51 151 179 143-159 172-186 0,000 HR= 6,205 (1,926-19,995) Bilateralidad Bilateral Unilateral 5 182 117 161 87-146 154-167 0,066 HR= 2,853 (0,883-9,217) Tamaño >20 mm ≤20 mm 79 112 147 167 135-159 160-174 0,005 HR= 2,271 (1,268-4,068) Ganglios afectos > 3 ≤ 3 15 164 132 162 104-161 156-169 0,083 HR= 2,104 (0,887-4,990) miR-222 Sobreexpresado Normal o reprimido 6 45 98 149 62-134 137-160 0,032 HR= 3,746 (1,021-13,750)
Tabla 31: Variables con influencia en la SG de la serie completa. Se muestra el
número de casos para cada categoría con su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank. Ninguna de las variables cumplía con los criterios de factor de confusión, por lo que no se realizó el análisis multivariante.
153 Luminales A N Madia IC (95%) p Log Rank Edad ≥50 años <50 años 90 29 153 182 144-163 175-188 0,004 HR= 10,596 (1,441-77,912) Bilateralidad Unilateral Bilateral 3 114 103 163 63-144 155-171 0,040 HR= 4,038 (0,951-17,137) Metástasis ganglionar Positivo Negativo 41 70 152 168 137-167 160-176 0,045 HR= 2,155 (0,997-4,661) IGF1R Sobreexpresado Normal o reprimido 50 21 168 142 158-178 121-163 0,065 HR= 0,419 (0,162-1,087)
Tabla 32: Variables con influencia en la SG de los Luminales A. Se muestra el
número de casos para cada categoría con su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank. Ninguna de las variables cumplía con los criterios de factor de confusión, por lo que no se realizó el análisis multivariante.
154 luminales B N Madia IC (95%) p Log Rank Edad <50 años ≥50 años 50 22 137 168 124-150 155-181 0,045 HR= 4,005 (0,920-17,441) Tamaño >20 mm ≤20 mm 34 38 135 148 116-154 140-156 0,015 HR=3,350 (1,193-9,407)
Mutación PI3K G1633A
Mutado Silvestre 3 48 110 152 80-141 138-166 0,088 HR= 3,484 (0,757-16,032) miR-222 Sobreexpresado Normal o reprimido 5 24 89 146 50-128 135-158 0,006 HR= 6,466 (1,415-29,542) miR-21 Normal Reprimido 12 13 107 150 86-129 137-163 0,017 HR= 3,045 (0,612-15,161)
Tabla 33: Variables con influencia en la SG de los luminales B. Se muestra el
número de casos para cada categoría con su media de supervivencia y el intervalo de confianza del 95% (Curvas de Kaplan-Meier), así como el valor p del test de comparación entre las curvas Log Rank. Ninguna de las variables cumplía con los criterios de factor de confusión, por lo que no se realizó el análisis multivariante.
157
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Las distintas entidades biológicas que integran el cáncer de mama y sus implicaciones moleculares, se han convertido en el centro de la investigación sobre esta neoplasia durante la última década (7-8, 16, 307). Sin embargo, tal y como vuelve a remarcarse en la reciente “14th St. Gallen International Breast Cancer Conference” (29), la aplicación de los resultados moleculares al diagnóstico clínico no se termina de conseguir y sigue siendo una prioridad aumentar el conocimiento sobre la heterogeneidad molecular de esta neoplasia, que permita identificar a los pacientes más adecuados para la terapia sistémica adyuvante. Los criterios histológicos y clínicos disponibles no logran discriminar a aquellos pacientes, que por su bajo riesgo de recaída y su baja respuesta esperada, no deberían ser sobretratados y por tanto expuestos a experimentar los efectos secundarios del tratamiento sin que éste vaya a derivar en algún beneficio (308). Este problema destaca en los pacientes con tumores luminales, puesto que existen claras evidencias de la convivencia de distintos subgrupos dentro de esta clasificación, que radican en distintos pronósticos y distintas respuestas al tratamiento (309-312).
La proliferación en el cáncer de mama luminal tiene su eje principal en la hiperactivación de la señalización estrogénica, mediada principalmente por su receptor
158 α o ESR1. Sin embargo, su actividad no siempre discurre por la vía de señalización por ligando sino que también es posible a través de su relación con otras proteínas (42). Tal es el caso de los receptores tirosina-quinasa (RTKs) para el factor de crecimiento epitelial (EGFR) y para el factor de crecimiento similar a insulina (IGF1R) y de la quinasa citosólica c-Src, que participan en la estimulación del ESR1 a través de la señalización de las vías de crecimiento MAPK y antiapoptótica PI3K (126). Una vez activado, el ESR1 sólo necesita entrar en el núcleo para, con la ayuda del mediador MED1 y sus coactivadores específicos, ejercer su función como receptor nuclear promoviendo la transcripción de genes que favorecerán el desarrollo tumoral (153). A este sistema de regulación de la señalización estrogénica hay que sumarle el papel de los microARNs, moduladores selectivos de cada uno de los participantes y de las vías de señalización principales que aportan un nuevo enfoque a la biología de estos tumores (41, 44, 217).
En el presente estudio, se ha evaluado un panel de genes y microARNs asociados a la señalización estrogénica en una serie de 220 tumores luminales, con la pretensión de conocer mejor su implicación en el comportamiento de estos tumores y estudiar cómo afectan en conjunto a su biopatología. En nuestra serie todos los tumores han mostrado al menos una alteración en las vías de señalización y otra alteración en los perfiles de expresión de los miRNAs. Se han detectado grandes diferencias que nos han llevado a considerar oportuna la evaluación de nuestra serie clasificando a los tumores en función de su fenotipo y de la presencia de mutaciones en el gen PI3KCA.
159 Luminales A silvestres
En los luminales A silvestres cabe destacar el papel del IGF1R. En general, la sobreexpresión de IGF1R por sí sola parece comportarse como un factor de buen pronóstico, en consonancia con los resultados de otros autores (102, 313), e incluso parece asociarse independientemente a tasas mejores de supervivencia global (tabla 32: 168 (158-178) vs 142 (121-163) meses, p(Log Rank)= 0,065; HR (Cox)= 0,419 (0,162- 1,087)).
El comportamiento mostrado por el EGFR es totalmente contrario al del IGF1R. En los luminales A, encontramos una asociación con tumores de alto grado de diferenciación, en consonancia con los resultados obtenidos por Gallardo en su serie de tumores HER-2 (113), a lo que hay que sumar un incremento del riesgo de metástasis ganglionar en un grado ≥N2 y una mayor presencia en tumores de mujeres jóvenes que afianza más todavía su potencia como marcador de mal pronóstico en estos tumores. Sin embargo sus niveles de expresión suelen ser bajos y no se sobreexpresó en ninguno de los tumores luminales A silvestres, primando además su represión en este subtipo (98,5%). Por lo que entendemos que su participación en la oncogénesis de estos tumores es mínima.
El papel del c-Src en este subgrupo es más complicado y parece modificarse en función de otros factores. La sobreexpresión del c-Src se muestra como un factor de protección frente a la metástasis ganglionar (tabla 15) en estos tumores, de acuerdo con otros autores (137). Sin embargo, la sobreexpresión de c-Src disminuye la SLE a largo plazo (tabla 29) y los tumores luminales A que expresan RPG al menos en el 10% de sus células, que suelen tener buen pronóstico y en nuestra serie han demostrado valores mejores de SLE a corto y largo plazo en estos tumores (tabla 29), expresan menos c-Src
160 que los tumores que expresan RPG en menos del 10% de sus células (figura 23). El c- Src puede actuar sobre muchas de las vías celulares en función de la señalización que reciba. Se ha demostrado que c-Src puede ser activado por el RE (a través de su dominio SH2) y por RPG (a través de su dominio SH3) (314), por lo que es posible que al aumentar la cantidad de RPG compita con el RE por la unión con el c-Src y modifique su actitud.
El MED1, no se relaciona con ninguna de las variables clínico-patológicas en estos tumores. Sin embargo su sobreexpresión tiende a asociarse a una SLE menor a corto plazo y, de forma codependiente con el c-Src, también a largo plazo (tabla 29). En este sentido, ya otros autores han demostrado que está implicado en la reaparición de la enfermedad en los tumores dependientes de la señalización estrogénica (315) e incluso que es necesario para la adquisición de resistencia tanto a fulvestrant (316) como a tamoxifeno (317).
Estos tres factores (IGF1R, cSRC y MED1) aparecen correlacionados con la expresión génica de ESR1 (tabla 26) en los luminales A silvestres, por lo que consideramos que estarían respondiendo a la señalización estrogénica en los luminales A. Entendemos que el ESR1, en su faceta de factor de transcripción, y ayudado en sus funciones por el MED1 (155), estaría promoviendo la transcripción del IGF1R y el c- Src (318), que a su vez protenciarían esta misma vía y otras (como la PI3K y la MAPK) para evadir la apoptosis y mantener el crecimiento tumoral. Sin embargo estos mecanismos oncogénicos sólo permitirían un crecimiento del tumor a ritmos lentos, explicando el buen pronóstico de estos tumores y su mayor SLE (figura 32).
Por otro lado, el IGF1R también se correlaciona en este grupo de tumores con el pri-miR-17~92 (Tabla 26), que a pesar de sus posibilidades oncogénicas parece
161 vinculado a su buen pronóstico, tendiendo a sobreexpresarse en los tumores <20 mm. En línea con la explicación que dábamos antes, la actividad transcripcional del ESR1 debería ser responsable de la estimulación de la expresión del cluster a través de la actividad de c-Myc y E2F1 (64, 217), y de hecho encontramos que aparece una correlación positiva con el nivel de expresión inmunohistoquímica del ESR1 únicamente en este grupo (Tabla 23), y entendemos que no se alcanza la significancia estadística por el tamaño de nuestra muestra. Sin embargo, el pri-miR-17~92 también muestra una gran correlación con el EGFR (Tabla 26), que es la única de las alteraciones que hemos encontrado asociada a mal pronóstico en los luminales A silvestres. Es posible que el cluster esté jugando un doble papel en estos tumores, regulando su desarrollo a nivel transcripcional y participando en la dirección de la actividad de sus vías. Uno de sus principales genes diana, más concretamente del miR- 17 y del miR-20, es el ZBTB4, cuya expresión se ha correlacionado con el aumento de la supervivencia libre de enfermedad en tumores de mama (240). Esta proteína de unión al DNA se ha caracterizado como uno de los principales represores transcripcionales del factor Sp1, con la consiguiente represión de los oncogenes Sp1-dependientes (240, 319), grupo que incluye tanto al ESR1 (59-60) como al EGFR y otros genes muy involucrados en el cáncer de mama como el BCL-2, la ciclina D1 y el VEGFR (240, 319), por lo que la expresión del pri-miR-17~92 estaría desregulando al Sp1 y promoviendo la expresión de estos genes. Por otro lado, el cluster consta de miRNAs capaces de inhibir la traducción de ESR1 (320) como el miR-18a (218) y de miRNAs capaces de reprimir su función como receptor nuclear a través de la represión de su coactivador AIB1, como el miR-17 (230). Hay que tener en cuenta que los niveles de expresión del pri-miR-17~92 no dependen tanto del nivel de transcripción como del nivel de procesamiento postranscripcional del pri-microARN para dar lugar a sus
162 microRNAs maduros, efectores finales del cluster. Se ha demostrado que la regulación postranscripcional depende de la estructura terciaria de este cluster y provoca una expresión diferencial de los miRNAs maduros (321), y que además, la selección de genes dianas es dosis-dependiente (322). Así pues, entendemos que los mecanismos que están regulando la expresión de este cluster de miRNAs y los que determinan el papel que juegan en estos tumores podrían ser definitivos en su oncogénesis, pero para conocerlos sería necesario analizar los niveles finales de cada uno de sus miRNAs maduros e incluso estudios funcionales en líneas celulares y en cultivos de tumores primarios que representaran los distintos escenarios en los que participan.
El otro miRNA que aparece correlacionado con el IGF1R es el miR-222 (tabla 26). Este hallazgo es inesperado por el carácter altamente oncogénico de este miRNA y por su correlación negativa con la expresión inmunohistoquímica del ESR1 (tabla 22), que si bien no alcanza la significancia estadística, corrobora los resultados publicados por otros autores (62, 208). No hemos encontrado literatura que pueda ayudarnos a explicar la interacción entre el IGF1R y el miR-222. Es posible que el miR-222, por su función represiva sobre el ESR1 (62, 208), sea capaz de frenar la actividad proliferativa derivada de la señalización estrogénica en estos tumores y por eso se correlacione también negativamente con el Ki67 (r= -0,428, tabla 22). Además, encontramos que este miRNA se correlaciona con el miR-206 y éste a su vez con el miR-21 (tabla 26), por lo que es posible que exista un eje de regulación común para todos ellos.
El miR-Let-7a fue el único miRNA capaz de discriminar entre los subtipos luminal A y B. En los luminales A silvestres se correlacionó negativamente con el Ki67, por lo que nuestros resultados demuestran el carácter antiproliferativo de este miRNA, que, de acuerdo con otros autores podría derivarse de su acción represora sobre la vía
163 cMYC-ESR1 o bien sobre Ras y la vía de las MAPK, en respuesta a la señalización estrogénica (46).
Luminales B silvestres
En los luminales B silvestres, el IGF1R vuelve a comportarse como un factor de buen pronóstico, de forma que se correlaciona inversamente con p53 (tabla 13) y su sobreexpresión se asocia a tumores menores de 20 mm y de bajo grado de diferenciación de Nottingham. Sin embargo, el resto de genes estudiados parecen asociarse al mal pronóstico de estos tumores.
Por el contrario, el EGFR parece tener más peso en la regulación de la biología de los luminales B, en los que su expresión por encima del percentil p75 supone un riesgo 34 (2-182) veces mayor de sobreexpresar p53 (p= 0,041) (figura 22), y además se correlacionan con un r=0,577 (tabla 14). La asociación entre el p53 alterado y la sobreexpresión de EGFR ya fue descrita en una serie de tumores de mama TN por el grupo de Shapira, que propuso que el mecanismo por el que se da esta asociación es que p53 mutante se une a la proteína p63, inhibiendo su función reguladora sobre el EGFR (323). Sin embargo, esta asociación implica un aumento del reciclaje endosomal del EGFR a nivel de proteína y la correlación que nosotros encontramos es a nivel transcripcional, por lo que diferentes mecanismos deben estar colaborando a distintos niveles. No obstante, llama la atención el rango de valores de expresión relativa del EGFR, que si bien podría estar provocado por el calibrador de nuestra serie, Gee y su grupo ya destacaron que los niveles de expresión del EGFR eran muy bajos en comparación con otros RTK como el HER-2 y el IGF1R, por lo que eran necesarios “análisis inmunohistoquímicos de alta sensibilidad”, y que precisamente esto podría
164 estar detrás de los diferentes resultados obtenidos en series equivalentes de tumores de mama (108). En nuestra serie la sola presencia de expresión del EGFR es suficiente para influir en la SLE (tablas 28 y 30) y en la SG (tabla 31), por lo que es posible que, tal y como señalaba Shapira, el aumento de actividad del EGFR no venga derivado de un incremento de su transcripción sino de una hiperactividad del RTK provocada por una disminución del reciclaje endosomal o por alguna alteración constitutiva del propio receptor. En este sentido, sería interesante estudiar la existencia de SNP o mutaciones en el EGFR en una muestra de tumores de mama de fenotipo luminal B, o incluso estudiar los cambios conformacionales del receptor, para esclarecer los mecanismos de su hiperactivación.
El c-Src se comporta, en estos tumores, como un factor de riesgo para la metástasis ganglionar (tabla 15), de forma totalmente contraria al grupo de luminales A, y se correlaciona inversamente con la expresión del BCL-2 (tabla 16: r= -0,385), considerado tradicionalmente como un factor de buen pronóstico del cáncer de mama. También se correlaciona negativamente con la expresión inmunohistoquímica del ESR1 (tabla 16: r= -0,464), que puede explicarse con los resultados de algunos estudios en modelos celulares que han comprobado la capacidad de c-Src de promover la proteolisis del ESR1 dependiente del sistema ubiquitina/proteosoma (134).
Según nuestros resultados, en los luminales B, las células tumorales habrían desregulado nuevas vías oncogénicas, por lo que la señalización en respuesta a E2 perdería su papel central. Como consecuencia el IGF1R, aunque continuaría estando sobreexpresado, perdería importancia en la biología del tumor y el c-Src actuaría en respuesta a señales de otros marcadores como el EGFR. Esta hipótesis ayudaría a explicar los resultados discordantes en líneas de cáncer de mama respecto a la relación
165 entre c-Src y ESR1 (125, 134) puesto que en función de la señalización que reciba, esta quinasa favorecerá unas u otras vías celulares.
En los luminales B, el coactivador de la transcripción MED1 se sobreexpresó 3,46 FC en los tumores bilaterales (figura 26), criterio de peor pronóstico en nuestra serie, y se reprimió en las pacientes de edad avanzada. Consideramos que actúa como un marcador de mal pronóstico en este grupo, en el que además, pierde la correlación con el ESR1. En línea con nuestra hipótesis, el MED1 estaría colaborando en los luminales B con otras vías distintas de la estrogénica, posiblemente con la vía MAPK, tal y como señalan algunos autores (147-148). Este marcador tiene especial relevancia en los tumores con sobreexpresión de p53. El MED1 participa en la entrada en apoptosis dependiente de p53, al promover la expresión de MDM2 y, como consecuencia, la degradación de p53 en los proteosomas (145) y al actuar directamente sobre el promotor de p53 para inhibir su transcripción (146). En las células tumorales con mutaciones en p53, como el 17,3% de los luminales B de nuestra serie, los cambios derivados de la alteración de la secuencia de p53 alteran esta interacción, de modo que MED1 deja de promover la transcripción de MDM2 y de inhibir al promotor de p53. Como consecuencia se produce una sobreexpresión del gen, que unida a la disminución de su proteolisis dependiente de MDM2, resulta en altos niveles de la proteína p53 mutada (144, 146).
Los tumores luminales B con metástasis ganglionar mostraron niveles del pri- miR-17~92 unas 4 veces mayores (figura 28), por lo que entendemos que tiene un papel oncogénico en este subgrupo. El carácter oncogénico del cluster 17~92 en estos tumores podría también derivar de la pérdida de función de p53 asociado a este grupo de tumores. Se ha demostrado en células de cáncer de mama que el p53 es capaz de regular a este cluster y sus dos clusters parálogos a través de la represión que ejerce sobre E2F1
166 (223). Esto implica que ante la mutación de p53, con la consiguiente pérdida de sus funciones reguladoras, el E2F1 aumentaría y en respuesta a su señal aumentaría también la expresión del pri-miR-17~92, lo que podría derivar en una actividad distinta de sus miRNAs que la que mostraba bajo señalización estrogénica, ya que como hemos explicado antes, la selección de los genes dianas del cluster parece ser dosis- dependiente (322).
Tumores Luminales Mutados en PI3KCA
En nuestra serie las mutaciones en el gen PI3KCA se han descrito con una frecuencia similar a la descrita por otros autores (71), predominando la mutación del dominio quinasa, con un 52,6 % de los casos mutados. Las alteraciones en este exón han sido vinculadas a tumores luminales con buen pronóstico, relacionándose con una actividad baja de mTORC1 y una buena tasa de respuesta a la monoterapia con tamoxifeno (324). El 77,4% de los tumores portadores de esta mutación de nuestra serie son del subtipo A. Sin embargo nosotros también encontramos una asociación de esta mutación con la afectación de ganglios en este subtipo (p=0,022) pues los dos casos con más de 10 ganglios afectados portan la mutación, aunque para poder dar validez a este resultado necesitaríamos un mayor número de casos del grupo N3.
Hay que tener en cuenta además, que en todos los tumores concurren otras alteraciones, lo que podría estar afectando al significado pronóstico de las mutaciones: el 88,5% tienen más de una alteración extra de las vías de señalización y el 11,5% restante tiene alterado el EGFR; además el 77,8% presentan varios de los patrones de expresión de los miRNAs estudiados alterados. En general, los mutantes del gen PI3KCA expresaron el EGFR con una frecuencia muy superior a los tumores silvestres,
167 hallazgo que ha sido descrito previamente en una serie de tumores del subtipo Her2 por