CHAPTER 4 The MOCAT 1.0 System Design
4.6 The influence() function
Los ARNm de los genes Slc38a1, Slc38a2 y Slc38a4 codifican por las proteínas SNAT1, SNAT2 y SNAT4. Está descrito que la expresión de los transportadores de L-alanina aumenta en el hígado en ayuno.269 Sin embargo, en la figura 52A y 52C se observa que no se produce un aumento de la expresión relativa de ARNm de los transportadores SNAT1 y SNAT4 a diferentes horas de ayuno tanto en ratones wt como en ratones AnxA6ko. En base a este resultado, se decidió determinar la cantidad de proteína endógena de las proteínas SNAT1, SNAT2 y SNAT4 en el hígado de ratón para ambos genotipos en estado basal y a las 24 horas de ayuno mediante la técnica de Western Blot. No obstante, no se ha podido analizar la proteína hepática endógena SNAT2 debido a que los anticuerpos comerciales y producidos en el laboratorio no han funcionado en nuestras muestras. La figura 53 muestra un aumento en la cantidad de proteína de SNAT1 a las 24 horas de ayuno en comparación con el estado basal tanto en ratones wt como en ratones AnxA6ko. Sin embargo, no hay diferencias en la cantidad de proteína en estado basal y a las 24 horas de ayuno al comparar ambos genotipos. En la figura 54 se observa un incremento en los niveles de la proteína SNAT4 a las 24 horas de ayuno con respecto al estado basal en ratones wt y AnxA6ko. Por otro lado, al comparar los niveles de proteína de SNAT4 entre ambos genotipos no hay diferencias significativas.
A B C
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Figura 53. A) Western Blot de las proteínas SNAT1 y GAPDH de homogeneizados de hígados
de ratón wt y AnxA6ko a 0 y 24 horas de ayuno. B) Cuantificación de los niveles de proteína SNAT1 a 0 y 24 horas de ayuno comparados con el control de carga, la proteína GAPDH.
Figura 54. A) Western Blot de las proteínas SNAT4 y GAPDH de homogeneizados de hígados
de ratón wt y AnxA6ko a 0 y 24 horas de ayuno. B) Cuantificación de los niveles de proteína SNAT4 a 0 y 24 horas de ayuno comparados con el control de carga, la proteína GAPDH.
4.11 Análisis de la interacción entre Anexina A6 y las proteínas SNAT1 y SNAT4 en hígado de ratón.
Al analizar los niveles de expresión relativa de ARNm (Figura 52) y los niveles de proteína endógena (Figura 53 y 54) de los transportadores de L-alanina SNAT1 y SNAT4 en ayuno no se observaron diferencias significativas entre ambos genotipos que pudiera explicar la incapacidad de captar el aminoácido L-alanina por parte de los hepatocitos aislados de los ratones AnxA6ko (Figura 18) y los bajos niveles en la síntesis de glucosa a partir de dicho aminoácido (Figura 17D). Este escenario plantea la posibilidad de que el mecanismo de acción de AnxA6 con respecto a los transportadores de L-alanina sea mediante la interacción y posterior traslocación a la membrana plasmática sinusoidal, ya que AnxA6 cambia su localización en respuesta a cambios de los niveles de colesterol y calcio intracelulares.173
A
A B
145 Para determinar si la incapacidad de los ratones AnxA6ko de captar el aminoácido L-alanina es consecuencia de la interacción de la proteína AnxA6 con los transportadores de L-alanina, SNAT1 y SNAT4, se realizaron inmunoprecipitaciones en hígado de ratón wt en estado basal y a 24 horas de ayuno.
La figura 55A muestra que en estado basal la proteína AnxA6 no interacciona con los transportadores del Sistema A, SNAT1 y SNAT4, en el hígado de ratón wt. Por otro lado, en la figura 55B podemos observar que a las 24 horas de ayuno la proteína AnxA6 no interacciona con los transportadores de L-alanina, SNAT1 y SNAT4 en el hígado de ratón wt. Estos resultados sugieren que la proteína AnxA6 no altera la función de captación de los transportadores de L- alanina SNAT1 y SNAT4 mediante su interacción en las condiciones experimentales de estudio utilizadas.
Figura 55. A) Inmunoprecipitación en hígado wt en estado basal entre la proteína AnxA6 y las
proteínas SNAT1 y SNAT4. B) Inmunoprecipitación en hígado wt a 24 horas de ayuno entre la proteína AnxA6 y las proteínas SNAT1 y SNAT4.
4.12 Determinación de la localización de las proteínas SNAT1 y SNAT4 en hígado de ratón.
Una vez descartado que la alteración de la captación de L-alanina por parte de los transportadores del Sistema A como consecuencia de la depleción de AnxA6 se deba a la afectación de los niveles de expresión relativa de ARNm (Figura 52), a la síntesis de proteína (Figura 53 y 54) y a la interacción entre AnxA6 y los transportadores de L-alanina (Figura 55), se estudia la posibilidad de que la falta AnxA6 esté alterando la localización de los transportadores de L-alanina.
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La captación de L-alanina por parte de los transportadores del Sistema A se realiza en la membrana plasmática sinusoidal de los hepatocitos, lugar de intercambio de los sustratos que llegan de la circulación sanguínea.2 Para
determinar si la depleción de la proteína AnxA6 altera la localización de los transportadores de L-alanina en el hígado de ratón, se realizaron inmunohistoquímicas de cortes histológicos de hígado de ratón en estado basal y a las 24 horas de ayuno en ratones wt y AnxA6ko. La figura 56 muestra que la proteína SNAT1 se encuentra en estructuras de apariencia vesicular en el interior del hepatocito tanto en estado basal como a las 24 horas de ayuno en ratones wt y AnxA6ko. Por otro lado, la figura 57 muestra que en estado basal la proteína SNAT4 se encuentra en vesículas en el interior del hepatocito y a las 24 horas de ayuno realiza un cambio de localización a la membrana plasmática sinusoidal en ambos genotipos.
Figura 56. Inmunohistoquímica de hígados wt y AnxA6ko a 0 y 24 horas de ayuno de la proteína
SNAT1 (verde), F-actina (rojo) y DAPI (azul). Núcleo (N), sinusoide (SN) y canalículo biliar (BC). Barra 10 µm.
147 Figura 57. Inmunohistoquímica de hígados wt y AnxA6ko a 0 y 24 horas de ayuno de la proteína
SNAT4 (verde), F-actina (rojo) y DAPI (azul). Núcleo (N), sinusoide (SN) y canalículo biliar (BC). Barra 10 µm.
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