INCOME STATEMENT
5 Trade and production activity of Ciech Group (continued)
5.2 Information about basic products, goods and services (continued)
E. faecium P13 Y E. faecium T136
111.2.10.1. Estabilidad físico-química de la sustancia antimicrobiana exocelular de E. faec¿um P13 parcialmente purificada
La estabilidad físico-química de la sustancia antimicrobiana de E. faeciumPl 3 se determinó empleando sobrenadantes o sobrenadantes concentrados obtenidos de cultivos deE. faeciumpl 3 desarrollados en caldo MRS a 320C durante 16 horas.
111.2.10.1 .1. Efecto de diversos enzimas proteolíticos. ~1ucolíticosy ilpolíticos
La sensibilidad de la sustancia antimicrobiana exocelular de E. faeciu>n P13 a diversos enzimas se realizó tratando el correspondiente sobrenadante con enzimas proteolíticos (tripsina, papaína, pepsina, proteasa II, proteasa VI y proteasa XIV), glucolíticos (a-amilasa) y lipolíticos (lipasa 1 y lipasa VII) a concentracionesde 1 y 5 mg/ml. Paralelamente, se prepararon controles consistentes en tubos con caldo MRS a los que se afladieron los enzimas a las mismas concentraciones y en un tubo con sobrenadante al que no se adicionó ningún enzima. Los tubos problema y control se incubaron en un bafio a 370C durante 6 horas con agitaci6n constante, tras lo cual se calentaron a 1000(2 durante 10 mm para, en su caso, inactivar los enzimas e inmediatamente se sumergieron en un baño de hielo fundente. La actividad antixuicrobiana de las muestras problema y control se determinó mediante el método de difusión en agar (sección 111.2.3.2) empleando como microrganismo indicadorE. faeciumT136.
111.2.10.1.2. Efecto combinado del nHy de la temperatura
El efecto combinado del pH y de la temperatura en la actividad antimicrobianaexocelular de
E. faeciumPl3 se determinó empleando alícuotas de sobrenadante cuyo pH se habla ajustado a
valores desde 2.0 a 11,0, con soluciones estériles de HCI y de NaOH de distintas normalidades. Paralelamente, se prepararon tubos contol consistentes en caldo MRS con el pH ajustado a los mismos valores. Todos las muestras se esterilizaron haciéndolas pasar a través de filtros de 0,22 ~xmde diámetro de poro. A continuación, los tubos se incubaron en un baño termostatado a 250C y en una cámara de refrigeración a 40(2 durante 24 horas. Finalizadas las incubaciones se
determinó la actividad inhibidora (Al, mm2,ml) de los sobrenadantes mediante el método de difusión en agar, empleando como microorganismo indicador E. faeciumT136. A partir de la actividad inhibidora se calculó la actividad inhibidora residual (AIR,
%)
que se define como el porcentaje que la actividad antimiaobianaa un determinadopH y a una determinada temperatura representa frente al valor máximo de actividad antiniicrobiana obtenido duranteel ensayo.111. Material y Métodos
111.2. 10.1.3. Termorresistencia a pH ácido y neutro
La estabilidad térmicade la actividad antimicrobiana exocelular deE. faeciumPl 3 se evaluó empleando sobrenadantesconcentrados con su pH ajustado a valores de 4.5 y 7,0 y obtenidos del siguiente modo: a partir de un sobrenadante de E.faecium P13 se prepararon dos alícuotas
que se liofilizaron durante 48 h y, a continuación, los extractos secos se resuspendieron en los tampones fosfato sódico 4 mM pH 4,5 y fosfato sódico 4mM pH 7,0, hasta un volumen veinte veces menor que el original. Las muestras se distribuyeron en alícuotas de 0,2 ml en viales de vidrio (10 x 30 mm) que, tras cerrarse herméticamente, se calentaron durante periodos de tiempo variables en un baño de polietilenglicol400 termostatadoa 80, 100, 121, 135 y 1500(2. Como control se emplearon alícuotas de las muestras que se mantuvieron sumergidas en un baño de hielo fundente.
111.2.10.1.3.1. Cinética de termodestrucción de la actividad antimicrobianaexocelular
Finalizado el tratamiento térmico, las muestras se enfriaron inmediatamente en un baño de hielo fundente, y se determinó su actividad inhibidora (Al, mm2/ml) y la de los controles, mediante la técnica de difusión en agar, empleando como microorganismo indicadorE. faecium
T136. A partir de la actividad inhibidora se calculó la actividad inhibidora residual (AIR, %), definiéndose ésta como el porcentaje que la actividad antiniicrobiana a un determinado pH y a una determinada temperatura representa frente al máximo valor de actividad antimicrobiana detectada en los controles. Posteriormente, se construyeron las gráficas de termodestrucción representando la actividad inhibidora residual en función del tiempo de calentamiento.
111.2.10.1.3.2. Parámetros cinéticos de termodestrucción
A partir de las gráficas de termodestrucción se calcularon asumiendo una cinética de primer orden los parámetros cinéticos de la inactivación térmica de la actividad antimicrobiana.
111.2.10.1.3.2.1. Tiempo de reducción decimal o valor “D
”
El valor “D” se define como el tiempo necesario para disminuir en un 90% la actividad antimicrobianainicial de los sobrenadantes concentrados deE. faeciumP13 a una temperatura determinada y se corresponde con el tiempo en que la curva de supervivencia atraviesa un ciclo logarítmico. Su valor numérico se determina a partir de la ecuación de la recta de regresión de la gráfica de termodestrucción en la que se representa el logaritmo de la actividad inhibidora residual en función del tiempo de calentamiento.
La ecuación de esta recta es: log x =-kt+ C
siendo, x, la actividad antimicrobiana residual k, la constante de inactivación en min’
t,el tiempo de calentamiento de las muestras
Asimismo,
logx2 - log x1 =-k (t2-
111. Material y Métodos logx1-logx2 t logx1-logx2 t2.tI
o
½- 0= log x1 - Iog x2Matemáticamente, “D” coincide con el inverso de la pendiente de la recta de regresión.
111.2.10.1.3.2.2. Tiempo medio (t112}
El tiempo medio, t112, se define como el tiempo requerido para que la actividad antimicrobianainicial se reduzca en un 50% a una temperatura determinada. Este parámetro puede determinarse gráficamente, representando el logaritmo de la actividad antimicrobiana residual en función del tiempode calentamiento, o matemáticamente, asumiendo queel cambio de la actividad antimicrobianacon respecto al tiempo es función de la actividad antimicrobiana inicial (ecuaciones 1 y 2):
dx dx
- —la(1) y . =kdt(2);
dt x
donde, x, representa la actividad antimicrobiana
t, es el tiempo de calentamiento a una temperatura determinada
k, es laconstantede inactivación de la actividad antimicrobiana en
mm-’.
Integrando la ecuación 2 entre dos valores de “x” diferentes (x0 y x1) a (t0 y t1), y siendo “x0” la actividad antimicrobiana inicial en el tiempot0,se obtiene: