Los anticuerpos policlonales se encuentran en el suero de los animales de laboratorio sometidos a la exposición continuada a un antígeno. Constituyen una mezcla heterogénea de anticuerpos procedentes de muchos clones de linfocitos B, que reaccionan frente a distintos determinantes antigénicos (Figura 12). La afinidad y especificidad de estos anticuerpos varía según los lotes de animales empleados en la inmunización, por lo que generalmente es preciso purificar los inmunosueros antes de su utilización en los imnuuoensayos.
111.2.2.1. Pauta de inmunización
Para obtener los inmunosueros se emplearon 3 lotes de 2 conejos machos de la raza Nueva Zelanda de 3-3,5 Kg de peso. Al primer lote se le inoculó el extracto antigénico de proteínas musculares solubles de salmón
ahumado (PSS>; al segundo lote el extracto antigénico de proteínas
musculares solubles de trucha ahumada (PST); y al tercer lote el extracto antigénico de las proteínas musculares solubles de la palometa ahumada (PSP).
La inmunización de cada lote comenzó con dos inoculaciones (una intradénnica, en varios puntos de la espalda del animal, y otra intramuscular) del extracto antigénico correspondiente (5 mg de proteína) emulsionado en
0,5 ml de Adyuvante Completo de Freund y 0,5 ml de solución salina estéril
(CINa al 0,85%). Las inoculaciones se prolongaron durante 4 meses a
intervalos de 1-2 semanas (Tabla 6), sustituyendo el Adyuvante Completo de Freund por el Incompleto a partir de la segunda inoculación.
Tabla 6. Pata de inninnizsciénsde ks conejospor inoculación de frs extractos dc sahuáz tniehay antigénicos .. EXTRACTOS M4TIGENICOS Días ¡‘SS (mg) ¡‘ST (mg) PSP (mg) SSE (mi) (mi) o 13 5 20 5 22 5 41 5 55 5 62 5 97 5 122 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0,5 0,5 0.5 1 0,5 0,5 1 0,5 1
PSS: Proteina Soluble de Salmón PST: Proteína Soluble de Trucha PSP: Proteína Soluble de Palometa
SSE: Solución Salina Estéril
ACF: Adyuvante Completo de Freund AIF:Adyuvante Incompleto de Freund SC: Inoculación Subcutánea
ID: Inoculación Intradérmica
IM: Inoculación Intramuscular S~: Sangría inicia]
Si: Sangría día 20 S~: Sangría día 41 S3: Sangría día 62 54: Sangría día 97 55: Sangría día 122 ACF AIF’ (mi) Inocuiaeión Sangría So Sc 0,5 Sc 1 SI ID/IM 0,5 SC 0,5 52 Sc 1 0,5 ID/INrI Sc ItvI 1 53 54 SS
Antes de la primera inoculación del extracto antigénico se realizó una
sangría inicial (Sa) para comprobar la ausencia de reactividad de los sueros de los animales frente al antígeno correspondiente. Así mismo, a los 20, 41, 62,
97 y 122 días de la primera inoculación, se realizaron sangrías parciales de la arteria central de la oreja, con el fin de verificar la eficacia de la inmunización.
Antes de proceder a la sangría final de los conejos, se comprobó, mediante la técnica del ELISA indirecto, que el titulo de los sueros procedentes de las sangrías parciales era suficiente.
111.2.2.2. Sangría final
Pasados 130 días del comienzo del proceso de inmunización y una vez
comprobado que el titulo de los ininunosueros era el adecuado, se efectúo la
sangría final (SE) de los animales. Para tal fin se anestesiaron los animales por vta intravenosa en la vena marginal de la oreja con pentobarbital (35 mg/kg
de peso). A continuación, se colocaron sobre una mesa en decúbito supino, inmovilizándoles las cuatro extremidades y, seguidamente, se les introdujo una aguja (18G) entre el cuarto y el quinto espacio intercostal de la región torácica. Cuando la aguja ya estaba en posición intracardiaca, se fije recogiendo la sangre en tubos de vidrio hasta el desangrado completo del animal.
¡11.2.23. Obtención y conservación del suero
La sangre se mantuvo 3 horas a temperatura ambiente para facilitar la formación del coágulo. A continuación, se separó cuidadosamente el coágulo
de las paredes de los tubos con ayuda de una espátula y se mantuvo a
durante 18 h para favorecer su retracción. El suero se trasvasó a tubos de
centrífuga y se centrifugó durante 20 miii a 3.000 x g a una temperatura de
4’C. El sobrenadante obtenido se dividió en alícuotas previaadición de azida de sodio (0,01% p/v>. Los viales de vidrio que contenían el suero se
111.2.2.4. Purificación pardal de los inmunosueros
Los inmunosueros obtenidos frente a las proteínas solubles de salmón ahumado (anti-PSS), trucha ahumada (anti—PST) y palometa ahumada (anti- PSP), se purificaron parcialmente mediante precipitación selectiva con sulfato
amónico al 50%.
La precipitación con sulfato amónico es uno de los métodos más utilizados para la separación de las proteínas de una solución acuosa. El método se basa en que las proteínas solubles forman puentes de hidrógeno con las moléculas de agua a través de sus grupos polares. Cuando se añaden concentraciones elevadas de ionesfuertemente cargados como el amonio y el
sulfato, éstos compiten con las moléculas proteicas por el agua. De esta fonna, las proteínas, al perder su unión con las moléculas de agua, disminuyen su solubilidad, lo que origina su precipitación. La concentración de sulfato amónico necesana para precipitar las inmunoglobulinas varía con la
especie animal de la que proceden, aunque la más conveniente en la mayoría de los casos es una solución al 50% (Harlow y Lane, 1988).
La precipitación de las inmunoglobulinas de los inmunosueros mili- PSS, anti-PST y anti-PSP se realizó de acuerdo con la técnica descrita por llarlow y Lane (1988). Para ello:
- Secentrifugaron lomldesueroa3.Oooxgdurante3ominyel
sobrenadante se Irasvasó a un vaso de precipitado.
- Se añadieron (gota a gota y agitando al mismo tiempo) 10 ml de
sulfato amónico saturado (76,1 g de (NF142.S04 en 100 ml de agua destilada) cuyo pH se babia ajustado a 7,4 con NaOH 1 N
inmediatamente antes de su empleo.
- La mezcla se mantuvo en reposo una noche a 40<3 y se volvió a
centiifúgar a 3.000 x g durante 30 mm para recuperar las inmunoglobulinas precipitadas.
- Eliminado el sobrenadante, las inmunoglobulinas presentes en el
(PBS, de pH 7,2) y, a continuación, se dializaron en tampón PBS con azida de sodio (10 id/ml) durante 16 h a 40<3~ Finalizada la
diálisis, las imnunoglobulinas se distribuyeron en alícuotas de 5 ml,
manteniéndose a -200C hasta su utilización.
111.2.2.5. Neutralización del suero con antigenos de especies heterálogas Con el fin de evitar las reacciones cruzadas de los anticuerpos policlonales frente a las proteínas de especies de pescado distintas de aquellas frente a las que se obtuvieron, se procedió a su neutralización. Para ello, los anticuerpos anti-PSS, anti-PST y anti-PSP, diluidos 1:2.000 en PBSTM (tampón PBS con un 1% de Tween 20 y un 1% de leche desnatada en polvo), se mezclaron con una cantidad apropiada de los extractos antigénicos de las especies heterólogas de pescado ahumado. El suero anti-PSS se bloqueó con 0,5 mg del extracto antigénico de trucha (PST) y 0,5 mg del de palometa (PSP) por ml de suero diluido. El suero anti-PST se bloqueó con 1,5 mg1ml de
los extractos antigénicos de salmón (PSS) y de palometa (PSP), y el suero anti-PSP se bloqueó con 0,1 mg/ml de los extractos antigénicos de salmón (PSS) y de trucha (PST). Las mezclas de cada suero con los extractos antigénicos heterólogos se incubaron durante 1 h a 370<3 y se utilizaron directamente en la técnica de ELISA indirecto.