Introduction

En este formato, la cantidad de anticuerpo que se une al conjugado hapteno-BSA inmovilizado en un soporte, es medida y correlacionada con la concentración de analito utilizando un anticuerpo secundario específico frente al primero. Este principio básico implica un paso adicional en el desarrollo de los inmunosensores, lo que supone un incremento en el tiempo de ensayo.

Al igual que en el formato anterior, la selección de las condiciones se realizó mediante ensayos de actividad, bajo el criterio de obtener máxima señal con la menor concentración de inmunorreactivos. De este modo, se estableció como óptima la inyección de una mezcla de 400 µl de disolución de anticuerpo primario diluido en PBS y 700 µl de medio orgánico, a un caudal de inyección de 0,25 ml/min, y 200 µl de anticuerpo secundario diluido 1/5000 en PBST, al mismo caudal.

La regeneración del inmunosensor se llevó a cabo utilizando un volumen de 2,5 ml de una disolución glicina 0,1M/HCl, pH 2, a un caudal de 0,5 ml/min. En este formato de ensayo la etapa de regeneración es menos crítica, ya que la especie inmovilizada sólo tiene que ser reconocida por el anticuerpo utilizado en cada ciclo; además, dada su naturaleza, el hapteno es más estable en estas condiciones.

Cabe destacar que, en este formato, las señales inespecíficas -debidas a la unión del anticuerpo secundario al inmunosoporte- son más importantes, lo que en principio limitó las condiciones de ensayo útiles para el desarrollo de inmunosensores.

Este estudio se llevó a cabo utilizando los conjugados CNA-BSA y CNH-BSA inmovilizados en GASc y CPG, los anticuerpos CNH-36, CNH-36 y CNH-45, en los medios orgánicos seleccionados para el formato directo.

En este caso, las dimensiones del inmunorreactor escogido al utilizar GASc como soporte fueron de 7 mm de longitud x 4 mm de diámetro interno. Este reactor es considerablemente mayor al utilizado en formato directo, ya que fue necesario una mayor cantidad de inmunosoporte para obtener señales útiles.

En el caso del soporte CPG, las dimensiones del reactor fueron las mismas que para el formato directo, debido a que las señales inespecíficas fueron muy importantes. En este caso, solo fue posible obtener señales útiles cuando se utilizó el anticuerpo monoclonal CNH-45, el medio orgánico M1 (50% MeOH – 50% PBST) y el conjugado CNH-BSA como especie inmovilizada. En estas condiciones, el valor de I50 obtenido

fue 34,2 µg/l.

En la Tabla 3.6 se muestran los resultados de los ensayos de competición correspondientes a este formato. Las siglas N.A. (no actividad) significan que, en esas condiciones, no se obtuvieron señales útiles para realizar los ensayos de competición. Las siglas N.C (no competición) muestran aquellas situaciones en las que aunque se obtiene señal suficiente para realizar los ensayos no se produjo inhibición en la señal.

Tabla 3.6. Valores de I50 (µg/l) obtenidos en formato indirecto con los dos conjugados hapteno-proteína inmovilizados en GASc. Ensayos realizados con los anticuerpos y medios orgánicos seleccionados

Medio Orgánico MAb CNH-BSA CNA-BSA

50%MeOH-50%PBST (M1) CNH-45 24,2±7,9 24,2±7,1

CNH-36 N.C 179,0±38,9

CNA-36 _{N.A 189,0±42,9}

50%MeCN-50%PBST (M2) _{CNH-45 N.C N.C}

CNA-36 N.A N.A 25%MeCN-75%PBST (LM2) _{CNH-45 N.C n.d} CNH-36 N.C n.d CNA-36 n.d n.d 25%MeOH-75%PBST (LM1) _{CNH-45 n.d n.d} CNH-36 80,4±19,5 64,4±16,7 CNA-26 N.A 60,4±19,5 25%MeOH-25%MeCN-50%PBST (M9) _{CNH-45 46,3±6,1 90,4±9,8} CNH-36 N.C N.A CNA-36 N.A N.C 25%MeOH-25%IS-50%PBST (M10) _{CNH-45 52,2±7,5 66,4±10,1} CNH-36 68,4±8,7 170,9±20,8

CNA-36 N.A N.A

10%AE-25%IS-65%PBST (LM7) _{CNH-45 N.C 94,5±8,7} CNH-36 N.C N.C CNA-36 N.C N.C 10%AE-25%MeOH-65%PBST (LM19) _{CNH-45 58,4±5,5 110,5±9,5} CNH-36 N.C N.C CNA-36 N.A N.C

MeOH: metanol; MeCN: acetonitrilo; IS: isopropanol; AE: acetato de etilo; PBST: PBS con 0.05% Tween 20. n.d: no determinado. Valores expresados como media ± desviación estándar (n=3), N.A: no actividad, N.C: no competición

A la vista de estos resultados, se observa también una relación entre sensibilidad y polaridad de la mezcla orgánica, ya que en las mezclas metanólicas la sensibilidad fue superior a la obtenida con los disolventes inmiscibles. En todos los casos, la mezcla M1 fue el medio orgánico más adecuado y el anticuerpo CNH-45 produjo los ensayos más sensibles, independientemente del conjugado hapténico utilizado (I50≅ 24 µg/l).

Es necesario señalar la influencia del formato de ensayo en el reconocimiento de anticuerpos de especies hapténicas. Así por ejemplo, el hapteno CNA -utilizado como trazador enzimático (CNA-HRP) en formato directo- es mal reconocido por el anticuerpo CNH-45 dada la falta de señal. Sin embargo, cuando esta especie está conjugada a BSA si es reconocida por dicho anticuerpo, pudiendo obtener los correspondientes inmunosensores basados en formato indirecto. Este hecho ha sido observado también por otros autores (44,191).

Respecto al protocolo de ensayo, el anticuerpo en forma nativa y el medio orgánico están en íntimo contacto durante el proceso de mezcla. Esto provoca la desnaturalización parcial de la inmunoglobulina, lo que redunda en un peor reconocimiento y por tanto, en una menor sensibilidad, efecto mucho más acusado en las mezclas que contienen disolventes inmiscibles. En formato directo, la resistencia de los anticuerpos en medios orgánicos es mayor al encontrarse inmovilizados.

Otro aspecto que influye en la baja sensibilidad obtenida en formato indirecto, es la existencia de factores estéricos que afectan al reconocimiento. En estos ensayos, el anticuerpo en disolución debe unirse al conjugado hapteno-proteína inmovilizado en el soporte, lo que supone un impedimento a la hora del reconocimiento por parte del anticuerpo, siendo necesaria una mayor concentración de esta especie para obtener suficiente señal. Este fenómeno produce una peor competición y por tanto, una menor sensibilidad.

Respecto a la vida útil de los inmunosensores, un reactor con conjugado inmovilizado en GASc pudo ser utilizado al menos 50 ciclos sin pérdida de actividad o cambios en las propiedades hidrodinámicas. Probablemente, la vida útil sea mucho mayor dado que, como especie inmovilizada, el conjugado es más estable que el anticuerpo; sin embargo, ésta no se estimó debido a la baja sensibilidad obtenida.