Methods

En el formato de ensayo de captura de inmunocomplejo se utiliza el soporte azlactona-Proteína A/G. Esta proteína, como ya se ha mencionado, es capaz de unir de forma orientada y reversible inmunoglobulinas de una amplia variedad de especies.

En estos ensayos se mezcla el anticuerpo disuelto en PB, con el trazador disuelto en PBT y el medio orgánico conteniendo el analito (o patrón), de modo que los inmunocomplejos se forman en disolución y posteriormente son fijados por el soporte. Tras un lavado con PBT, se añade el substrato enzimático con el fin de cuantificar la cantidad de trazador unida al soporte. Esta descripción genérica corresponde al protocolo de ensayo simultáneo. Utilizando este inmunosoporte, la desorción es segura y completa utilizando 2,5 ml de una disolución glicina 0,1M/HCl, pH 2.

En este formato, la cantidad de soporte (proteína A/G) no es restrictiva -dado que su finalidad es unir los complejos formados en disolución-, por lo que se utilizó un reactor de dimensiones idénticas a las del formato directo.

Para el desarrollo de estos inmunosensores se ensayaron los mismos anticuerpos, medios orgánicos y trazadores que para el formato directo, utilizando como tampón de trabajo PB conteniendo Tween 20 (0,05% v/v) para eliminar las señales inespecíficas, según pruebas preliminares efectuadas en batch.

Respecto a la reusabilidad, el soporte pudo ser utilizado hasta 300 ciclos sin mostrar pérdida en su capacidad de reconocimiento. El reactor se guardaba en PB con 0,02% NaN3 y el soporte era cambiado cuando mostraba impedimentos al flujo o se

observaba una disminución en su actividad.

Los ensayos de actividad realizados utilizando los trazadores CNH-HRP y CPNU-HRP indicaron que el anticuerpo CNA-36 mostraba actividad en los medios orgánicos M1, LM2, LM7, M10, LM19 y LM20, mientras que los anticuerpos CNH-36 y CNH-45 sólo producían señal en los medios orgánicos conteniendo disolventes miscibles en agua (M1, LM2 y M10).

En estas condiciones, se realizaron los ensayos de competición para determinar la sensibilidad de los inmunosensores objeto de estudio. Los valores de I50 se muestran

en la Tabla 3.7, en la que puede observarse de nuevo que los ensayos más sensibles se obtienen al aumentar la polaridad de la mezcla.

Tabla 3.7. Valores de I50 (µg/l) obtenidos en formato de captura con los anticuerpos monoclonales estudiados. Ensayos realizados con los trazadores y medios orgánicos seleccionados

Medio orgánico

CNA-36 CNH-36 CNH-45

CNH-HRP CPNU-HRP CNH-HRP CPNU-HRP CNH-HRP CPNU-HRP

M1 11,9 ± 2,3 11,8 ± 1,9 32,5 ± 4,0 43,4 ± 6,3 11,1 ± 2,3 9,1 ± 2,0

LM2 78,5 ± 5,8 35,4 ± 3,8 47,3 ± 6,1 71,7 ± 6,9 16,8 ± 3,7 34,2 ± 4,3

LM7 49,8 ± 4,0 83,5 ± 6,3 n.a n.a n.a n.a

M10 14,5 ± 2,1 12,2 ± 2,0 57,4 ± 5,9 101,0 ± 8,1 21,4 ± 5,3 24,8 ± 3,9

LM19 59,7 ± 4,8 58,7 ± 5,5 n.a n.a n.a n.a

LM20 96,3 ± 6,9 110,6 ± 8,1 n.a n.a n.a n.a

M1: 50% MeOH (metanol)-50% PBT; LM2: 25% MeCN (acetonitrilo)-75% PBT; LM7: 10% AE (acetato de etilo)-25% IS (isopropanol)-65% PBT; M10: 25% MeOH-25% IS-50% PBT; LM19: 10% AE-25% MeOH-65% PBT; LM20: 5% AE-25% MeCN-70% PBT; PBT: PB con 0.05% Tween 20; n.a: no actividad; Valores expresados como media ± desviación estándar (n=3)

La mejor sensibilidad se obtiene utilizando el anticuerpo CNH-45 junto con el trazador CPNU-HRP y el medio orgánico M1 (I50, 9,1 µg/l).

Respecto a los anticuerpos utilizados, el CNA-36 fue más resistente al efecto de las mezclas orgánicas, lo que parece estar relacionado con la capacidad de regeneración de este anticuerpo observada en formato directo. Por otro lado, el anticuerpo CNH-45 se mostró más sensible en los medios orgánicos en los que fue posible realizar los ensayos de competición, excepto en la mezcla M10. Este hecho concuerda con los datos obtenidos en formato indirecto, donde este anticuerpo mostró los mejores resultados. De los tres anticuerpos ensayados, el CNH-36 fue el menos resistente a los medios orgánicos investigados y produjo los ensayos menos sensibles. De hecho, en las mejores condiciones de ensayo (mezcla M1), se obtuvieron valores de I50 32,5 y 43,4 µg/l al

utilizar CNH-HRP y CPNU-HRP, respectivamente.

Finalmente, se ensayó el protocolo de ensayo secuencial que, como ya se ha expuesto en la parte experimental (sección 2.8.3), consiste en la inyección del anticuerpo disuelto en PB y lavado del exceso del mismo previamente a la inyección de la mezcla de trazador enzimático y medio orgánico. En este caso, las señales obtenidas fueron muy inferiores a las alcanzadas utilizando el protocolo simultáneo. Por ejemplo, trabajando con el anticuerpo CNH-45, la mezcla M1 y el trazador CPNU-HRP, se obtuvo un valor de I50 de 20,7 µg/l, mientras que fue de 9,1 µg/l en el protocolo

simultáneo (Tabla 3.7). Estos resultados parecen lógicos dado que en el protocolo simultáneo todas las especies involucradas en la reacción inmunoquímica están en disolución.

Comparando los tres formatos de ensayo estudiados, se aprecia que el de captura produce los ensayos de mayor sensibilidad, debido probablemente a las condiciones en que se produce la competición. En los inmunosensores en formato directo (anticuerpos inmovilizados) la reacción de competición se produce en la superficie del inmunosoporte, lo que implica que las especies que están en disolución deben difundirse hasta los sitios de unión del anticuerpo. Los procesos de difusión son por lo general lentos -ya que están controlados por el transporte de materia desde la interfase hasta los sitios de unión- y además, pueden aparecer impedimentos estéricos e interacciones electrostáticas que dificulten dicho proceso.

En el caso de los ensayos en formato indirecto, también ocurren estos fenómenos, aunque es el anticuerpo (más voluminoso) el que debe difundirse hasta la especie inmovilizada (conjugado hapteno-proteína).

En el caso del formato de captura, todas las especies están en disolución y la reacción inmunoquímica se produce de forma instantánea, no siendo afectada por la presencia de superficies ni por efectos de difusión. En contrapartida, las especies proteicas en forma nativa pueden desnaturalizarse en presencia de medios orgánicos con mayor facilidad que cuando se encuentran inmovilizadas (214).

3.4.4. Recapitulación

En la Tabla 3.8 se resumen los resultados obtenidos en las condiciones de máxima sensibilidad y carga orgánica, con los inmunosensores desarrollados para carbaril basados en anticuerpos monoclonales.

Cabe destacar que, los ensayos más sensibles se obtienen en formato de captura. En formato directo se han seleccionado dos medios orgánicos, uno correspondiente a la máxima sensibilidad y otro a la mezcla orgánica binaria con mayor porcentaje de disolvente orgánico, que será el empleado para el análisis de muestras reales. En el caso de formato indirecto para el mismo Ab y soporte, se han seleccionado los dos conjugados hapteno-proteína, dado que prácticamente no existen diferencias de sensibilidad.

Tabla 3.8. Resumen de las características de los inmunosensores para carbaril FORMATO

DIRECTO INDIRECTO CAPTURA

Anticuerpo CNA-36 CNH-45 CNH-45

Trazador CNH-HRP CPNU-HRP --- --- CPNU-HRP

Conjugado --- --- CNH-BSA CNA-BSA ---

Soporte GAHz GASc PAG

IN M U N O R R EA C TI V O S

MEDIO ORGÁNICO 25% MeOH- 25% IS- 50% PBST 50% MeOH- 50%PBST 50% MeOH- 50%PBST 50% MeOH- 50%PBT 13,5 17,3 24,2 24,2 9,1 4,2 1,4 3,2 2,4 0,7 I50 (µg/l) LD (µg/l) RD (µg/l) 6,5-31,2 3,8-68,0 6,8-131,7 5,8-137,5 2,0-44,9

GAHz: gel de agarosa con grupos hidrazina; GASc: gel de agarosa con grupos N-hidroxisuccinimida; PAG: gel de agarosa con proteina A/G inmovilizada; MeOH: metanol; IS: isopropanol; PBST: PBS con 0.05% Tween 20; PBT: PB con 0.05% Tween 20; LD: límite de detección; RD: rango dinámico