Key messages and implications

4.3.3.1 Separación de mononucleares por gradiente de densidad

Las células mononucleares de las muestras de médula ósea de los tubos 2 y 4 (contenidas en tubos con EDTA como anticoagulante), fueron separadas por medio de un gradiente de densidad antes de realizar los procedimientos de extracción de RNA de acuerdo con el siguiente protocolo:

1. _{Todos los procedimientos fueron realizados en una cabina de flujo laminar}

2. _{Transferir el contenido total del tubo 2 a un tubo falcon de 50 ml y adicionar 26 ml de PBS}

1X estéril

3. _{A un tubo falcon estéril adicionar 15 ml de medio de separación de linfocitos (Lymphocyte}

Separation Medium. Producto 17-829E. Lonza Walkersville Inc. US)

4. _{Con una pipeta estéril y utilizando un pipeteador automático, transfiera lentamente la mues-}

tra de médula ósea resuspendida en PBS, teniendo precaución de que no se produzca mezcla entre la muestra y el medio de separación

5. _{Centrifugue a 85 x g por 20 minutos a temperatura ambiente}

6. _{Deben obtenerse cuatro capas claramente visibles correspondientes a: plasma, células}

mononucleares, medio de separación y glóbulos rojos

7. _{Centrifugue a 85 x g por 20 minutos a temperatura ambiente}

8. _{Con una pipeta de Pasteur estéril transfiera la capa de mononucleares a un tubo falcon estéril}

de 50 ml y una vez transferidas la mayor cantidad posible de células, lleve nuevamente a vol- umen con PBS 1X estéril.

9. _{Centrifugue a 85 x g por 20 minutos}

10. _{Descarte el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 5 ml de PBS 1X estéril} 11. _{Repita los pasos con el tubo 4}

4.3.3.2 Conteo de células y determinación de la viabilidad celular

La determinación de la concentración de células se realizó mediante la utilización de un contador automatizado de células (TC20™ Automated Cell Counter. Bio-Rad Laboratories Inc.). La determinación de la viabilidad en este equipo se realizó mediante la coloración con azul tripan. El protocolo utilizado fue el siguiente:

1. _{A un tubo cónico de microcentrífuga transfiera 10µl de la muestra de células mononucleares}

obtenida luego de la seperación por gradiente de densidad. Antes de transferir la muestre asegúrese de resupender adecuadamente las células.

2. _{Adicione 10 µl de azul tripán y mezcle con la pipeta en diez ocasiones} 3. _{Transfiera 10 µl de la mezcla a la lámina de conteo así:}

• _{Coloque la punta de la pipeta en un ángulo de 45 grados en el área de carga de la muestra.} Utilice inicialmente la cámara marcada con la letra A

• _{Introduzca la punta de la pipeta hasta hacer contacto y deposite la muestra evitando la} formación de burbujas

• _{Encienda el contador automático y coloque la USB que viene con el mismo en el puerto} marcado con la letra A

• _{Introduzca la lámina en la ranura correspondiente del equipo, verificando que este hacia} arriba y asegurandose que se inserte en el sentido correcto indicado por las flechas

4. _{El equipo iniciara el conteo de forma automática. Una vez muestra la imagen de microscopia}

ajuste los limites para seleccionar células entre 6 y 10 micras.

5. _{Registre el valor del conteo celular en unidades por ml y el porcentaje de células viables} 6. _{Guarde el archivo en la memoria USB con el número del paciente}

7. _{Repita los pasos con las células de cada tubo}

4.3.3.3 Extracción y cuantificación del RNA

Para la extracción del RNA se seleccionó un kit comercial (miRCURYTM

RNA Isolation

Kit - Cell & Plant. Exiqon Inc. 12 Gill Street, Suite 1650 Woburn, MA 01801 US), el cual se

fundamenta en un procedimiento de cromatografía de adsorción en columna, utilizando una resina como matriz de separación. Este método tiene la ventaja de purificar preferencialmente el RNA de otros componentes celulares como las proteínas sin el uso de fenol o cloroformo. El procedimiento fue realizado siguiendo las instrucciones del fabricante así:

1. _{Transfiera 100 ul de mononucleares obtenidos por gradiente de densidad a partir de médula}

ósea a un tubo de microcentrífuga libre de RNAsa

2. _{Adicione 350 ul de solución de lisis (provista por el Kit) a la muestra. Lise las células en un}

vortex por 15 segundos. Asegurese que la muestra sea transparente antes del siguiente paso.

3. _{Adicione 200 ul de etanol al 95% al lisado y mezcle en un vortex por 10 segundos} 4. _{Adsorción del RNA a la columna}

• _{Mantenga la centrifuga y los buffers a temperatura ambiente}

• _{Ensamble una columna en uno de los tubos de recolección provistos por el kit}

• _{Adicione 600 ul del lisado con etanol en la columna y centrifuge por un minuto a 14.000 x g} • _{Verifique que todo el lisado haya pasado a través de la columna}

• _{Descarte el flujo que paso y vuelva a ensamblar la columna en el tubo colector. Si el volumen}

del lisado es superior a 650 ul, agregue el lisado restante a la columna y centrifugue a 14.000 x g por un minuto

5. _Lavado

• _{Una vez realizada la adsorción a la columna deben realizarse lavados para eliminar}

materiales no deseados

• _{Prepare la Solución de Lavado provista por el Kit (TRIS HCL) a una concentración de}

trabajo adicionando 50 ml de etanol al 95% a la botella que contiene la Solución de Lavado concentrada. El volumen final debe ser de 72 ml. Marque en la casilla de verificación que se encuentra en la etiqueta de la botella que se ha adicionado etanol

• _{Aplique 400 ul de la solución de lavado a la columna y centrifugue por 1 minuto a 14.000 x g}

descartando el flujo que pasó. Repita este paso dos veces más hasta realizar tres lavados

• _{Centrifugue la columna por dos minutos a 14.000 x g para secar completamente la resina} 6. _Elución

• _{Coloque la columna en un tubo de elución de 1.7 ml}

• _{Adicione 50 µl del buffer de elución provisto por el kit a la columna} • _{Centrifugue por dos minutos a 200 x g, seguido de 1 minuto a 14.000 x g}

• _{Realice la cuantificación según el protocolo anexo y diluya el RNA con agua libre de}

RNAsas para lograr aliquotas con una concentración final de 5 ng/µl

La cuantificación del RNA se realizó en un espectofotómetro (NanoDrop 2000. Thermo Fisher Scientific. Wilmington, Delaware, US), valorando la concentración de RNA en la muestra y la pureza determinada por la relación 260/280, considerando adecuadas muestras con una concentración de más de 5 ng/µl y con una relación 260/280 de 1.8 a 2.0.