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2. 4. 1. Procedimiento de preparación de las muestras, para la extracción de ADN de H. parasuis.

Previamente a la extracción del ADN de H. parasuis, se realizo una preparación de los diferentes tipos de muestras empleados en esta investigación, como se describe a continuación:

• Los cultivos bacteriológicos positivos, se cultivaron en placas de agar base sangre con satelitismo de Staphilococcus aureus (ATCC No.12605), se caracterizaron bioquímicamente y se incubaron por 48 horas hasta que las colonias típicas del H. parasuis, alcanzaron un crecimiento logarítmico no mayor a 2 x 109 unidades formadoras de colonias (UFC). Luego se tomo una alícuota con un asa estéril y se resuspendió en 5 ml aproximadamente de solución salina estéril (0.85% p/v). De esta suspensión, se tomo 1 l y se transfirió a un tubo eppendorf de 1.5 ml, a partir de la cual se realizo la extracción del ADN.

• A partir de los exudados líquidos, colectados a partir de líquido pericárdico, abdominal, toráxico ó LCR, se tomó 200 L y se transfirió a un tubo eppendorf de 1.5 ml.

• Los tejidos, se colectaron, en una cantidad aproximada de 50 – 100 mg, en un tubo eppendorf de 1.5 ml, con la finalidad de conservar futuras muestras del caso. A partir de este primer tubo se tomo para la extracción 25 mg del tejido, de acuerdo a lo reportado por Lora A, (2002), en la cual se recomienda esta cantidad de tejido con el fin de obtener una alta concentración de ADN y se deposito en un segundo tubo eppendorf de 1.5 ml, en el cual se adicionó 300 l de solución tampón salina de fosfato (PBS, pH 7.4) y posteriormente dicha mezcla se macero con un pestler por 1 minuto.

• A las muestras colectadas con hisopos, se procedió a tomar con unas pinzas la cabeza del hisopo e introducirla en un tubo eppendorf de 1.5 ml. Luego el cuerpo del hisopo que sobresalía del tubo se cortó y se le adiciono 300 L de PBS. Se cerró el tubo y se mezclo en el vortex durante un minuto, para que la muestra recolectada con el hisopo se homogenizara con el PBS (Oliveira y col, 2001).

2.4.2. Extracción de ADN de H. parasuis, por el método de Proteínasa K y Fenol-

cloroformo-isoamílico.

A partir de de la preparación preliminar de las muestras de cultivos, exudados líquidos, tejidos e hisopos anteriormente descrita, se procedió a realizar la extracción de ADN utilizando el método de Proteínasa K y Fenol-cloroformo-isoamílico, para la recuperación del ADN de H. parasuis. La preparación de los reactivos y soluciones empleadas en el proceso de extracción de ADN, se describen en el Anexo 6.

El método de Proteínasa K y Fenol-cloroformo-isoamílico incluye cinco pasos fundamentales: Homogenización, Separación de fases, Precipitación del ADN, Lavado del ADN y resuspensión del ADN.

• Homogenización. Se partió de un volumen de 200 L de cada muestra y se centrifugó a 20.800 gravedades por 15 minutos a temperatura ambiente. Luego se aspiró el sobrenadante y el “pellet” fue resuspendido en 200 L de PBS (50mM de Tris-HCl, 1mM EDTA, [pH 7.4]), empleando vortex durante un minuto (Oliveira y col, 2001; San Millan y col, 2007). Luego, en cada tubo eppendorf se adicionó 10 l de Proteínasa K con una concentración de 10 mg/ml (Invitrogen, Cat. No. 25530-015) y se incubó por un periodo de 1- 3 horas, en baño serológico a 55°C (Sambrook y col, 1989; Lo y col, 1998; Oliveira y col, 2001 y San Millan y col, 2007).

• Separación de fases. Se dejaron enfriar los tubos y se les adiciono 220 l de la mezcla Fenol-Cloroformo-Isoamílico (Invitrogen, Cat. N°. 15593-049), se taparon y se mezclaron manualmente por inversión suave, para luego centrifugarlos a 15.300 gravedades por 15 minutos para permitir el aislamiento del ADN intacto. • Precipitación. La fase superior acuosa (donde se encuentra el ADN), fue

transferida a un segundo tubo de 1.5 ml, en el cual se había agregado previamente 1 ml de etanol absoluto frió (Merck, Ref: K32.983183), para precipitar el ADN. El tubo se mezcló por inversión suave, se llevó a incubar durante dos horas a -20°C. Luego se centrifugo por 10 minutos a 20.800 gravedades.

• Lavado. Luego se descarto el sobrenadante y el sedimento fue lavado utilizando 1 ml de etanol al 70% v/v, se mezcló manualmente hasta que se desprendió totalmente el sedimento del tubo y se llevó nuevamente a centrifugación a 20.800 gravedades por 5 minutos.

• Resuspensión. Se descartó cuidadosamente el sobrenadante y el sedimento húmedo se llevó a secar por una hora, en un horno de aire seco, a una temperatura de 60°C. Luego, el sobrenadante se resuspendió en 60 l de agua DEPC tratada con dietilpirocarbonato (SIGMA, D5758), libre de nucleasas y se incubó por 1 hora a 65°C en el baño serológico, con el fin de disolver el ADN. El ADN fue almacenado a -70°C para su posterior utilización.

2.4.3. TÉCNICA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PARA H. parasuis (PCR Hps).

El procesamiento de las muestras para detectar el Ácido Nucleico (ADN) de H.

parasuis se realizó por medio de la técnica de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR) descrita por Oliveira y col, (2001) y Angen y col, (2007), en la cual se empleó dos regiones especie-especificas para el genoma de la bacteria H.

parasuis, a partir de las cuales se diseño una pareja de iniciadores HPS-F y HPS-R,

con un tamaño predictivo de amplificación de 821 pares de bases (pb).

Para el análisis bioinformático, se empleo la base de datos de genética, del Centro de Información Biotecnológico Nacional de los Estados Unidos [National Center for Biotechnology Information, NCBI], con la finalidad de comparar la similaridad de las secuencia de los iniciadores utilizados en esta investigación con las secuencias reportadas en esta base de datos. Por este motivo, se accedió a la Herramienta de Búsqueda Básica de Alineamiento Local [Basic Local Alignment Search Tool, BLAST], que se encuentra en la base de datos anterior y se busco la similitud entre las secuencias de los nucleótidos de los iniciadores empleados y las secuencias reportadas por otros investigadores en el GenBank. El alineamiento pareado de las bases, demostró que las secuencias de iniciadores utilizadas (Tabla 16), presentaron alineamiento exclusivamente para el H. parasuis.

Por otro lado, los oligonucleótidos de las secuencias de los iniciadores se analizaron en el programa Integrated ADN Technologies (IDT XX), en el cual se pudo determinar que la secuencia del iniciador HPS-F tenía un contenido de GC de 55.0%, una temperatura de anillamiento de 63.2 °C y un peso molecular de 6333.1 g/mol y que la secuencia del iniciador HPS-R tenía un contenido de GC de 61.1%, una temperatura de anillamiento de 63.0°C% y un peso molecular de 5417.5 g/mol. Asimismo, la concentración ajustada por reacción de los oligonucleótidos en los iniciadores se estimo que fue de 0.3 µM, la del magnesio de 1.5mM y la de los

dNTPS de 0.2mM. Los iniciadores fueron sintetizados por INVITROGEN.

Tabla 16. Iniciadores empleados en la normalización de la técnica de PCR para

H. parasuis.