6 the Koran itself had used it for the same purpose?

Todos los datos mostrados en esta tesis nos llevan a la conclusión general del importante papel de cFLIP en células epiteliales de mama, tumorales o no, en cuanto a la supervivencia celular y como regulador de la apoptosis mediada por el ligando de muerte TRAIL. Por ello es de gran relevancia conocer los mecanismos de regulación de los niveles basales de expresión de cFLIP. Está descrito que cFLIP es una proteína de vida media corta, cuya degradación está mediada por el sistema ubiquitinación/proteasoma [216]. Por todos estos antecedentes y para profundizar en el mecanismo que mantiene los niveles basales de cFLIP en las células, decidimos estudiar, por una parte, cómo se regula la degradación de cFLIP y por otra, cómo se regula su síntesis.

3.1 Regulación de la degradación de cFLIP.

Para determinar si el proteasoma está implicado en la degradación de cFLIP en células de mama, tratamos células MCF-10A y MDA-MB231 con el inhibidor de la síntesis de proteína cicloheximida y, al mismo tiempo, tratamos con el inhibidor del proteasoma MG-132. Como se observa en la Figura 21, tras tres horas de tratamiento con cicloheximida se ha perdido casi la totalidad de la proteína, y esta pérdida se ve bloqueada en presencia del inhibidor de proteasoma. Estos resultados se confirmaron utilizando epoxomicina como inhibidor del proteasoma.

El mecanismo de degradación de proteínas por el proteasoma implica la ubiquitinación previa de las proteínas a degradar. Esto significa que cFLIP debe ubiquitinarse, lo cual ha sido descrito [216] y para ello requiere de una proteina E3-ubiquitin ligasa específica. Se conocen pocas proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasas que puedan tener como proteína diana a cFLIP. Recientemente se ha descrito a ITCH como la E3-ubiquitin ligasa de cFLIPL que promueve la degradación proteasomal de éste tras el tratamiento con TNF [116]. Por ello decidimos comprobar si esta proteína era también la E3-ubiquitin ligasa de cFLIP en condiciones basales. Así, inhibimos la síntesis de cFLIP mediante cicloheximida, cuando los niveles de ITCH estaban reducidos por siRNA (utilizamos dos siRNA diferentes) y comprobamos si en estas condiciones la degradación de cFLIP se bloqueaba.

Figura 21. La degradación de los niveles basales de cFLIP es mediada por el proteasoma. Células MCF-10A (A) o MDA-MB231 (C) se trataron con el inhibidor del

proteasoma MG-132 a las dosis indicadas una hora antes del tratamiento con el inhibidor de la síntesis de proteína cicloheximida (5µg/ml). La cicloheximida se mantuvo durante 3 horas y posteriormente los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH (A) y α- tubulina (C). (B) células MCF-10A se trataron con los inhibidores del proteasoma MG- 132 (50µM) y Epoxomicina (200nM) una hora antes del tratamiento con cicloheximida (5 µg/ml). La cicloheximida se mantuvo durante 3 horas y posteriormente los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. En la misma membrana y como control de carga se analizaron los niveles de GAPDH.

Como se observa en la Figura 22 A-B, aunque los niveles de ITCH están muy reducidos, cFLIP sigue degradándose. Esto nos lleva a la conclusión de que ITCH no es probablemente la proteína E3-ubiquitin ligasa responsable de mantener los niveles basales de expresión de cFLIP en estas células.

Dado este inesperado resultado, decidimos estudiar si alguna de las proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasas que en la literatura se asocian a cFLIP o a proteínas relacionadas con este, podrían ser la responsable de la ubiquitinación para la degradación de cFLIP en condiciones basales. Por ello decidimos testar si Cul-3 (E3-ubiquitin ligasa de caspasa-8), MULE (E3- ubiquitin ligasa de Mcl-1), XIAP (recientemente se han descrito funciones

Figura 22. Estudio de la implicación de la proteína E3-ubiquitin ligasa ITCH en la degradación proteasomal de cFLIP. Células MCF-10A fueron transfectadas con oligos de

siRNA para ITCH, o con el oligo scrambled (A-B) durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Posteriormente las células se trataron con cicloheximida (5µg/ml) durante 3 horas y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. De igual modo se comprobó que los niveles de ITCH. Como control de carga se midieron los niveles de GAPDH.

ubiquitin ligasa para los IAPs durante la señalización por receptores de muerte [338] [118]), y TRAF2 (se ha descrito que puede unirse cFLIP y además tiene actividad E3-ubiquitin ligasa) [278], podrían tener como proteína diana de ubiquitinación a cFLIP. Así, disminuimos los niveles de dichas proteínas mediante siRNA y comprobamos si al inhibir la síntesis de cFLIP, su degradación se bloquea. Como se observa en la Figura 23, la

Figura 23. Estudio de la implicación de diferentes proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa en la degradación proteasomal de cFLIP. Las líneas celulares indicadas en la figura,

se transfectaros con oligos de siRNA para Cul-3 (A), XIAP (B), RIP, TRAF2 (C), Mule (D,E,F,) o el oligo scrambled durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Tras este tiempo, las células se trataron con cicloheximida (5µg/ml) durante 3 horas y los niveles de cFLIP se determinaron por western blot. Como control de carga se midieron los niveles de GAPDH. F) Para comprobar si los nivles de MULE disminuían con el siRNA, realizamos un ensayo funcional donde células MDA-MB 231 fueron trasfectadas con oligos de siRNA para MULE o con el oligo scrambled durante 48 horas como se describe en Materiales y Métodos. Pasado este tiempo se trataron con Nocodazol (400ng/ml) durante 24 horas. Los niveles de cFLIP y MCL1 se analizaron por western blot, ya que está descrito que MULE es la ubiquitin ligasa de MCL1, por lo tanto una bajada de expresión de MULE provoca una acumulación de MCL1 o una no degradación de esta por Nocodazol.

A)

B)

C)

ninguna de las proteínas testadas, lo que nos indica que en principio, ninguna de estas proteínas con actividad E3-ubiquitin ligasa responsable de la degradación de cFLIP por el proteasoma en condiciones basales.

3.2 Regulación de la síntesis de cFLIP.

Se ha descrito que la expresión inducible de cFLIP en células de cáncer de mama está regulada principalmente por la ruta de PI3K/AKT, a través del factor de trascripción FOXO3A [246]. Por ello decidimos estudiar si el RNA mensajero de cFLIP (cFLIPL y cFLIPS) se afectaba al inhbir la ruta

de PI3K-AKT con el inhibidor específico LY294002. Como se observa en la Figura 24A, en diferentes líneas celulares de cáncer de mama, la inhibición de la ruta PI3K-AKT induce una bajada en los niveles de ARN mensajero de FLIPS, pero no de cFLIPL que tras 8 horas de tratamiento incluso parece que

aumentan. Con estos datos sobre el efecto de la inhibición de la ruta de PI3K-AKT sobre el ARN mensajero de cFLIP, decidimos analizar cómo se afectaba la proteína. Como se observa en la Figura 24B, tras 4 horas de tratamiento con diferentes dosis de LY294002, se induce una bajada de los niveles de proteína cFLIPS, lo que se corresponde con la bajada del ARN mensajero. Sin embargo y, aunque es más leve, también se produce una disminución en los niveles de proteína cFLIPL, lo que no tiene relación con

los efectos observados sobre el ARN mensajero. Además resulta bastante sorprendente, que a la dosis de LY294002 de 10µM en la que la ruta de PI3K- AKT se encuentra inhibida, esto es, se inhibe la fosforilación de AKT, los niveles de proteína no se vean afectados.

Por ello, y para determinar si el efecto del LY294002 sobre cFLIP era específico o no de la inhibición de la ruta PI3K-AKT, decidimos utilizar otro inhibidor de la ruta como es wortmanina. En este caso (Figura 25A), los niveles de proteína de cFLIP no se afectan como con LY294002, aunque en ambos casos la ruta PI3K/AKT está inhibida como se determina por la bajada de fosforilación de AKT. Estos resultados se confirmaron utilizando un compuesto análogo estructuralmente al LY294002, el LY303511 con una reducida actividad como inhibidor de la fosforilación de AKT.

Figura 24. LY294002 regula los niveles de ARN mensajero y proteína de cFLIP en células de cáncer de mama. A) Diferentes

líneas celulares de cáncer de mama fueron tratadas con LY294002 (50 µM) durante los tiempos indicados. Los niveles de ARN mensajero de cFLIPL y cFLIPS se determinaron mediante RT-PCR y RT-PCR cuantitativa como se describe en Materiales y Métodos. B) Células MDA-MB231 se trataron con las dosis indicadas de LY294002 durante 4 horas y los niveles de cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot.

A)

Como se observa en la Figura 25B, aunque LY303511 es capaz de inhibir parcialmente la fosforilación de AKT, no consigue el grado de inhibición de la ruta como LY2094002 y sin embargo el efecto sobre cFLIP es el mismo. Con estos datos confirmamos que el efecto del LY294002 sobre los niveles de cFLIP es independiente de su actividad como inhibidor de la ruta PI3KAKT. Por tanto, para corroborar la no participación de la ruta PI3K/AKT en la regulación de la síntesis de cFLIP, decidimos sobrexpresar en las células una proteína AKT constitutivamente activa (Myr-AKT) que mantiene la ruta activada, o una proteína dominante negativa de AKT (dnAKT) que, por el contrario, inhibe la ruta. Como se observa en la Figura 26A activando la ruta de PI3-K/AKT mediante la transfección de la proteína constitutivamente activa de AKT, no conseguimos aumentar los niveles de cFLIP. Por el contrario, la transfección de las células con la proteína dominante negativa

Figura 25. La disminución de los niveles de proteína de cFLIP por LY294002 es independiente de la inhibición de la ruta PI3K-AKT. (A) Células MDA-MB231 fueron

tratadas con los inhibidores de PI3K-AKT a las dosis indicadas durante 4 horas y los niveles de proteína cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot. (B) Células MDA- MB231 se trataron con LY294002 (50µM), LY303511 (50µM ) y wortmanina (100nM) durante 4 horas. Los niveles de proteína de cFLIP y p-AKT se determinaron por western blot.

de AKT no consigue bajar los niveles de cFLIP (Figura 26B), aunque la ruta se encuentra inhibida, como lo muestra la bajada de sustratos fosforilados de AKT tras el tratamiento con insulina en células donde se expresa el dominante negativo.

Así concluimos que la ruta PI3-K/AKT no participa en la regulación de los niveles basales de cFLIP en células de cáncer de mama.

Figura 26. La regulación de cFLIP en células tumorales de mama es independiente de la actividad PI3K/AKT. Células MDA-MB231 fueron electroporadas con construcciones

constitutivamente activa (A) y dominante negativa (B) de AKT como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles de cFLIP y el estado de fosforilación de AKT se determinó mediante western blot.

Por otra parte, la activación de la ruta de NF-kB puede derivar en el aumento de expresión de cFLIP [254] [255]. En estos trabajos se describe cómo el aumento de actividad de NF-kB mediante TNF o LPS aumentan los niveles de cFLIP y con ello la resistencia de las células a la apoptosis inducida por TRAIL o Fas ligando. En células de glioblastoma, la resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL está determinada por el aumento de cFLIPS mediado por mTOR [193]. La inhibición de la ruta por rapamicina, provoca una bajada en los niveles de cFLIPs, al no permitir la traducción del ARN mensajero de cFLIPS a proteína, permitiendo la sensibilización de estas

células a la apoptosis inducida por TRAIL. La caseina quinasa 2, también controla la sensibilidad de células de carcinoma endometrial a la apoptosis inducida por TRAIL o Fas ligando, por regular los niveles de cFLIP [267]. Con estos antecedentes decidimos utilizar inibidores estas rutas y comprobar si alguna era la responsable del mantenimiento de los niveles basales de expresión de cFLIP en células de cáncer de mama. Así utilizamos BMS 345541 como inhibidor de NF-kB, rapamicina como inhibidor de m- TOR y TBB como inhibidor de la caseina quinasa 2. Como se ve en la Figura 27, sólo el BMS 345541 parece tener un claro efecto sobre los niveles de cFLIP. Si este efecto se da también a nivel del ARNm y si es un efecto específico de inhibir la ruta y no un efecto inespecífico del inhibidor, necesita de un estudio más detallado.

Figura 27. Regulación de los niveles de expresión de cFLIP por los inhibidores de diferentes rutas de señalización. A) Células MDA-MB231 se trataron con rapamicina

(100nM) durante los tiempos indicados. Los niveles de cFLIP se analizaron mediante western blot. (B) Células MDA-MB231 se trataron con rapamicina (100nM) 30 minutos, 4 horas o 8 horas antes de tratar con insulina (10µg/ml) durante 30 minutos. Los niveles de p-p70SK6, p-AKT y AKT se determinaron por western blot. Como control de carga se analizó la expresión de α-tubulina. (C) Células MDA-MB231 se trataron con las dosis indicadas de BMS345541 durante 6 horas y los niveles de cFLIP y p-NF-kB se determinaron por western blot. (D) Células MDA-MB231 fueron tratadas con DRB (40µM) o con las dosis indicadas de TBB durante 6 horas y los niveles de cFLIP se analizaron por western blot.

A)

B)