2 can be understood from one of his stanzas.

1. MATERIALES. Cultivos celulares.

Las lineas celulares humanas de cáncer de mama MCF-7 [316], MCF-7- Bcl-2 que expresan establemente la proteína BCL-2 [317], MCF-7 E6 que establemente expresan la proteína E6 del papilomavirus humano[318], se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Las células MCF-7-Bcl-2 y MCF-7E6 fueron ademas suplementadas con 0,5mg/ml de Geneticina (G418).

Las líneas celulares humanas tumorales de mama MDA-MB231 [319] y MDA-MB231-FLIPL, que expresa establemente la proteína FLIPL [320] se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina.

Las líneas celulares humanas de cáncer de mama BT474 [321] y MDA- MB435s [322], se cultivaron en medio DMEM igualmente suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Las células MDA-MB435s fueron además suplementadas con 10µg/ml de insulina.

Las células MCF-10A son células epiteliales derivadas de tejido mamario humana normal (Pauley, Soule et al, 1993) y fueron amablemente cedidas por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel University, Filadelfia, USA). Se cultivaron en medio DMEM F12 (1:1) suplementado con 5% de suero de caballo inactivado (HS), 10µg/ml de insulina, 20ng/ml de factor de crecimiento epidermal (EGF), 10ng/ml de toxina colérica, 500ng/ml de hidrocortisona, 2mM de L-glutamina 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina. Las células MCF-10A–FLIPL, MCF-10A-FLIPS, MCF-10A–Bcl2

Las células HEK293T, son una línea primaria de células embrionarias de riñón humano, transformadas con ADN de adenovirus humano tipo 5 (AD5) y nos fueron amablemente cedidas por el Dr. Antonio Rodríguez (CNIO, Madrid). Se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100µg/ml de estreptomicina y 500 U de penicilina.

Todas las células fueron mantenidas en un incubador humificado a 37ºC, 5% de CO2 y 95% de aire.

Reactivos.

Los medios RPMI 1640, DMEM y DMEM F12 (1:1), así como el EGF, la hidrocortisona, la insulina, el suero bovino fetal (FBS), la L-glutamina y los antibióticos (penicilina/estreptomicina) se obtuvieron de Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA). El suero de caballo se obtuvo de Gibco (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA).

El TRAIL recombinante con cola de histidinas, así como el TRAIL recombinante biotinilado (TRAIL-b) fueron producidos en nuestro laboratorio como se describe más adelante. El TRAIL-R2/Fc recombinante humano se adqurió de R&D Systems.

Doxorrubicina, Rapamicina, Cicloheximida, Wortmanina, LY294002, LY303511, Nocodazol, Roscovitina, TBB, MG132 e Insulina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El Vorinostat (SAHA) se obtuvo de Selleck Chemicals, USA. El Interferón gamma se obtuvo de Peprotech EC LTD (London, UK). Flavopiridol fue amablemente cedido por Dr. José Ramón Suarez (Aventis Pharmaceutical, Bridgewater, NJ). El 17-DMAG fue obtenido de LC Laboratorios (Woburn, USA). BMS fue otenido de Calbiochem Novabiochem GMBH (Band Soden, Alemania). La epoxomicina fue obtenida de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El inhibidor general de

caspasas benzyloxy-carbonyl-Val-Ala-Asp-(OMe) fluoromethylketone (Z- VAD-FMK) fue proporcionado por Bachem, AG (Bachem, Bubendorf, Suiza). Las sondas Taqman para la amplificación de mRNA de cFLIPL y

cFLIPS mediante PCR cuantitativa fueron diseñadas por Applied

Biosystems. La sonda Taqman para la amplificación de mRNA de HPRT como gen endógeno en la RT-PCR Real time se obtuvo de Applied Biosystems (Número de catálogo 4331182). La Taqman Universal PCR Master Mix se obtuvo de Applied Byosistems (Número de catálogo 4304437). Las placas de 96 pocillos para la realización de la PCR en tiempo real se adquirieron de Sorensan TM y el adhesivo para sellar la placa se obtuvo de Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania).

Anticuerpos.

El anticuerpo anti-FLIP NF6 se obtuvo de Alexis (San Diego, Ca, USA). Los anticuepos anti-FADD, anti-Bid, anti-XIAP, anti-ITCH y anti-RIP se obtuvieron de BD Transduction Laboratorios (New Jersey, USA). Los anticuerpos anti-Bax, anti-TRAF2, anti-Mcl-1, anti-pERK y anti-GAPDH se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Los anticuerpos anti-pIkB, anti-pJNK, anti-pAKT, anti-p-P70SK6, anti-AKT, anti- p-sustratos de AKT, anti Cul-3 fueron de Cell Signalling Technology; CA, USA). Los anticuerpos anti-TRAIL-R2 y anti-TRAIL fueron de R&D Systems (Mn, USA). El anticuerpo anti-Bcl-2 se obtuvo de DAKO (Glostrup, Dinamarca). El anticuerpo anti-Tubulina se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El anticuerpo anti-Citocromo C se obtuvo de Pharmingen (San Diego, CA, USA). El anticuerpo anti-Caspasa-8 fue amablemente cedido por el Dr. Gerald Cohen (Leicester University, UK). El anticuerpo anti-Actina fue amablemente cedido por el Dr. Mauricio Reginato (Drexel University, Philadelphia, USA). Los anticuerpos frente a los receptores de

TRAIL utilizados para citometría de flujo (TRAIL-R1 (HS101), TRAIL-R2 (HS201), TRAIL-R3 (HS301) y TRAIL-R4 (HS401)) fueron adquiridos de Alexis Corp. (San Diego, CA, USA).

Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP) o con isotiacinato de fluoresceína (FITC) fueron adquiridos de DAKO (Glostrup, Dinamarca). El reactivo quimioluminiscente ECL se obtuvo de Millipore (Billerica, MA, USA).

ARN de interferencia (siRNA).

Los siRNA de interferencia utilizados corresponden a las secuencias de cDNA humano para las siguientes proteínas y se obtuvieron de Sigma- Proligo (Woodlans, TX, USA).

cFLIP: 5´-GGGACCUUCUGGAUAUUUUdTdT-3´, cFLIPL (5´-GAGCAUACCUGAAGAGAGAdTdT-3’), cFLIPS: 5´-CACCCUAUGCCCAUUGUCCTTdTdT-3´, Caspasa-8: 5´-GGAGCUGCUCUUCCGAAUUdTdT-3´, FADD: 5´-GAAGACCUGUGUGCAGCAUdTdT-3´, TRAIL-R2: 5´-GACCCUUGUGCUCGUUGUCdTdT-3´, Bid: 5´-GAAGACAUCAUCCGGAAUAdTdT-3´, ITCH-1: 5´-AAGUGCUUCUCAGAAUGAUGAdTdT-3´, ITCH-2: 5’-AACCACAACACACGAAUUACAdTdT-3’, XIAP: 5´-GCUGUAGAUAGAUGGCAAUdTdT-3´, Cul-3: 5´-GUCGUAGACAGAGGCGCAAdTdT-3´, RIP: 5´-CCACUAGUCUGACGGAUAAdTdT-3´, TRAF-2#1: 5´-GUGUCGAGUCCCUUGCAGAdTdT-3´, TRAF-2#2: 5’-UCUGCAAGGGACUCGACACdTdT-3’ MULE: 5´-GAGUUUGGAGUUUGUGAAG-3´,

2. METODOLOGÍA.

Cuantificación de la viabilidad celular (Cristal Violeta).

La viabilidad celular se determinó por tinción con cristal violeta (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) tal y como lo describen Sanchez et al J. Biol. Chem. 271: 7416-7422. Resumidamente: 35.0000 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y tras el tratamiento correspondiente, se retiró el medio de cultivo y se lavaron tres veces con PBS 1X. A continuación, las células que quedaban adheridas a la placa se tiñieron con 250 µl de una solución de 0.2% de Cristal violeta en etanol al 2%, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se lavaron los pocillos con agua, y una vez secos, se lisaron las células con una solución de SDS al 1%. La densidad óptica de cada pocillo se midió en el lector de placas Varioskan Flash (Termo Electrón Corporation) a la longitud de onda de 590 nm.

Cuantificación de apoptosis.

La apoptosis se cuantificó por citometría de flujo mediante la detección de células hipodiploides. Para ello, se sembraron 3x105 _{células por pocillo y,} tras el tratamiento correspondiente, se recogieron con Tripsina. Se fijaron y permeabilizaron con 900 µl de una solución de etanol frío al 70%, agitando suavemente en el vórtex e incubando 5 minutos en hielo. Después de lavar, se añadieron 250 µl de Solución de Extracción de ADN (0’2M Na 2HPO4, 0’1M ácido cítrico en PBS; pH 7’8) y se incubaron durante 10 minutos a 37ºC. A continuación y, tras lavarlas, las células se resuspendieron en 250 µl de Solución PI/RNasa (100 µg/ml RNasa, 40 µg/ml de Yoduro de Propidio en PBS) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en oscuridad. Las células apoptóticas se detectaron y cuantificaron en la población del ciclo celular con menor contenido en ADN que las células el pico G1 (SubG1). La

citometría de flujo fue realizada en un citómetro FACScan, utilizando el programa Cell Queso Pro (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) para el análisis de los datos.

En células tumorales de mama MCF-7 la cuantificación de la apoptosis se realizó mediante el estudio por citometría de flujo de la externalización de la fosfatidilserina utilizando la proteína Anexina V-FLUOS (Roche), la cual se une a este fosfolípido en presencia de Ca2+. Las células se resuspendieron en un tampón de incubación (Hepes NaOH 10mM pH 7’4, NaCl 140 mM, CaCl2 5mM) con Anexina V-FLUOS a la concentración indicada por el fabricante durante 15 minutos a temperatura ambiente. El porcentaje de células positivas para la externalización de la fosfatifilserina se analizó en el citómetro de flujo por la cuantificación de células postivas para la tinción con Anexina V-FLUOS.

Inmunodetección de proteínas por western-blot.

Para el análisis de expresión de proteínas, tras recoger las células, estas se lavaron una vez en PBS 1X y posteriormente se resuspendieron en tampón de carga Laemli (Sample buffer, 50mM de Tris-HCl pH 6’8, urea 6M, 2-Mercaptoetanol 6%, SDS 3%, 0’003% de Azul de brofofenol). Posteriormente se sonicaron e hirvieron las muestras y las proteínas se separaron mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida, a un porcentaje del 7,5%, 10% o 12% dependiendo del peso molecular de la proteína a detectar. Para la preparación del gel se utilizó Lower Buffer (1), Upper Buffer (2), Acrimalmida, Agua, APS (ammonium persulfate, Sigma- Aldrich), TEMED (Sigma-Aldrich). La electroforesis se realizó en Running Buffer (3), a un voltaje constante de 140 voltios durante 1 hora aproximadamente. Las proteínas de este gel se transfierieron a una membrana de PVDF (Immobilon, Millipore), previamente tratadas con

metanol y mantenidas en Buffer de Transferencia (4), mediante la técnica de transferencia semiseca con el sistema Trans-Blot, SD (Bio-Rad) a 50mA constantes (por gel a transferir) durante una hora, o a 15 voltios constantes (independientemente del número de geles a transferir) durante 30 minutos. La membrana se bloqueó con una solución PBS 0’1% Tween 20 (PBS/Tween) con 5% de leche en polvo durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente se lavó la membrana con PBS-Tween y se incubó con el anticuerpo correspondiente durante 1 hora a temperatura ambiente, o a 4ºC durante toda la noche en agitación. Tras la incubación con el anticuerpo, se lavó la membrana 3 veces con PBS-Tween durante cinco minutos cada lavado, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una solución PBS-Tween 5% de leche en polvo y el anticuerpo secundario correspondiente, que lleva acoplado la peroxidasa del rábano picante (HRP). De nuevo se hiceron tres lavados de cinco minutos cada uno con PBS-Tween y se incubó la membrana con el reactivo ECL (Millipore) durante cinco minutos, tras lo cual se reveló mediante quimioluminiscencia.

Para el análisis de muestras tras la medida de concentración de proteínas, las células se lisaron con tampón de lisis (250mM Tris-Hcl pH 7’5, 5mM EDTA, 5nM EGTA, 5% Tritón X-100, 50mM Na-β-glicerofosfato, 250mM NaF, 5mM ortovanadato sódico, 25mM NaPPi, 27mM Sacarosa, 1X inhibidores de proteasas) y se recogieron con un raspador. Se dejaron 30 minutos en hielo y se centrifugaron a 4ºC durante 10 minutos a 13.000 rmp. Se recogió el sobrenadante y se le calculó la concentración de proteínas. A la misma cantidad de proteína se le añadió el volumen correspondiente de tampón de carga Laemli. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel SDS-poliacrilamida como se ha comentado anteriormente.

1) Lower Buffer 4X (pH 8’8) 2) Upper Buffer 4X (pH 6’8) 90’85 g Tris-base (Roche) 6’06 g Tris-base 20 ml SDS 10% (Sigma) 4 ml SDS 10% Agua hasta 500 ml Agua hasta 100 ml

3) Runnig Buffer 5X (pH 8’3) 4) Buffer de Trasferencia 10X 15 g Tris-base 58 g Tris-base

72 g Glicina (Sigma) 29 g Glicina 5 g SDS 3’7 g SDS Agua hasta 1 litro Agua hasta 1 litro

Medida de la concentración de proteínas.

Con el fin de cuantificar la cantidad de proteínas que se ha obtenido tras recoger las células, se utilizaron los reactivos de BioRad (Hercules, CA, USA): Bio-Rad Dc Protein Assay Reagent A, B y S. Para ello se hizo una curva patrón con BSA desde 1µg/µl hasta 8µg/µl, sobre la cual se extrapolaron los valores obtenidos de las muestras y se obtuvo la concentración de proteína. En primer lugar se añadieron 5µl de muestra (o una cantidad menor, pero siempre completando hasta 5µl con el buffer en que estuviera diluída la muestra), a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano. En el caso del blanco, se añadieron 5µl del buffer. A continuación se añadieron 25µl de la Solución A´ (1ml de Solución A + 20µl de solución S). Posteriormente se añadieron 200µl del reactivo B. Se dejó incubando 15 minutos a temperatura ambiente y se midió la fotometría a una longitud de onda de 750 nm en el lector de placas Varioskan Flash (Termo Electron Corporation).

Análisis de los receptores de TRAIL en la superficie celular mediante citometría de flujo.

Para detectar la expresión de receptores de TRAIL en la superficie celular, se utilizaron 2x106 _{células. Se despegaron del sustrato con un} rascador en PBS y, una vez lavadas, se resuspendieron en 100µl de PBS. Posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (5 µg/ml) a 4ºC durante 30 minutos. Después de lavar con PBS para eliminar el exceso de anticuerpo primario, se incubaron con un anticuerpo secundario anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en una dilución 1:20 durante 30 minutos a 4ºC en oscuridad. Las células se volvieron a lavar con PBS y se resupendieron en 200µl de PBS. La detección de los receptores de muerte se realizó con un citómetro de flujo FACScan, utilizando el programa Cell Queso Pro (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) para el análisis de los datos.

Producción de TRAIL recombinante y TRAIL biotinilado recombínate (Trail-b).

El TRAIL recombinante, así como el el TRAIL recombinante biotinilado (TRAIL-b), fueron producidos a partir de una construcción amablemente cedida por la Dra. Marion MacFarlane (MCR Toxicology Unit. Univerisity of Leicester, UK) que codifica para TRAIL recombinante (aminoácidos 95-281) insertada en BamHI/XhoI del vector pET-28b(+) con resistencia a kanamicina y una cola de seis histidinas para facilitar la purificación de la proteína recombinante (MacFarlane et al., 1997). Brevemente: se transformaron bacterias BL21 con 1-2 µg de ADN por choque térmico y se crecieron en medio LB (Luria-Bertani), con 20mM de glucosa y 30µg/ml de kanamicina. Cuando el precultivo alcanzó la densidad óptica de 0.6-0.8 a la longitud de onda de 600nm se indujo la síntesis de la proteína recombinante añandiendo al cultivo 0.5µM de IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido). Tras tres horas de inducción a temperatura ambiente, las bacterias se

recogieron por centrifugación y se lisaron, tras un lavado con PBS 1X, en un tampón de lisis que contiene 30mM de Tris-HCl (pH 7,5), 150mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100 e inhibidores de proteasas. Este lisado se incubó en un rotor circular durante 16 horas a 4ºC, en una columna de sefarosa quelada con Niquel (Quelatin Sepharose Fast Flow; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suiza), a la que el TRAIL quedará unido por la cola de histidinas. Transcurrido este tiempo, se lava la columna seis veces con PBS frío antes de eluir el TRAIL con una solución 100mM de EDTA en PBS. Las fracciones más purificadas se titularon en actividad realizando un ensayo de apoptosis en células HeLa, sensibles a TRAIL y se almacenaron a - 80ºC.

En el caso del TRAIL biotinilado, antes de eluir la proteína de la columna, se incubó con 50 µg/ml de reactivo de biotinilización (Ácido D- biotil-ε-aminocaproico N-Hidroxisuccinimida éster; Roche) durante 1 hora a 4ºC, tras lo cual, se eluyó con una solución 150 mM de EDTA en PBS.

Análisis del DISC de TRAIL.

El aislamiento del DISC de TRAIL fue realizado utilizando TRAIL biotinilado recombínate (TRAIL-b), sintetizado en nuestro laboratorio. Las células, 20x106 _{por tratamiento fueron incubadas con o sin doxorrubicina} 500ng/ml durante 15 horas. Tras este tiempo, las células se trataron con 1µg/ml de TRAIL-b durante 15, 30 ó 60 minutos. Posteriormente se lavaron las células con PBS frío tres veces y se lisaron en 3ml de tampón de lisis (30mM Tris-HCl pH 7’5, 150mM de NACl, 10% de glicerol, 1% de Triton X- 100, 0’1% de deoxicolato, inhibidores de proteasas (Complete Inhibitors de Roche)) durante 30 minutos en hielo. El lisado se recogió en tubos eppendorfs y centrifugó en una minifuga durante 30 minutos a máxima velocidad. Se recogieron los sobrenadantes, guardando 50µl como control

interno (Input). El DISC de TRAIL fue aislado de la misma cantidad de proteína en cada caso utilizando 30 µl de sterptavidina-agarosa (Sigma) incubando toda la noche a 4ºC en frío en un rotor circular. Los precipitados se lavaron 6 veces con 500 µl de tampón de lisis y posteriormente se añadió 30 µl de tampón de carga 1X y se hirvieron a 95ºC durante 5 minutos para su análisis protéico por western blot.

Fraccionamiento celular.

Para detectar la liberación de citocromo C de la mitocondria al citosol y la translocación de Bax desde el citosol a la membrana mitocondrial tras un estímulo apoptótico se separó la fracción mitocondrial (membranosa) de la citosólica. Para ello se lavaron las células en PBS y se resuspendieron en 30µl de tampón de lisis frío (80 mM de KCl, 250mM de sacarosa, 100µg/ml de digitonina (Sigma-Aldrich), 0’1 mM de PMSF (Fenilmetilsulfonil Fluoruro, Boehringer Ingelheim GmbH; Ingelheim, Alemania), 1mM de DTT (1,4- Dithiothreitol, Roche) e inhibidores de proteasas en PBS. Tras incubar en hielo durante 8 minutos (en células MCF-7), se centrifugaron 5 minutos a 10.000 rpm en frío y se recogió el sobrenadante (fracción citosólica). El sedimento (fracción membranosa) se lavó con PBS y se resuspendió en Laemli Buffer. Se utilizaron 50 µg de proteína de la fracción citosólica y una cantidad proporcional de la fracción membranosa para la detección de las proteínas citocromo C y Bax mediante western blot.

RT-PCR ( Transcripción reversa de ARN y amplificación de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)).

El ARN total de las células se aisló utilizando el sistema de aislamiento de ARN, TRIzol (Invitrogen; Eugene, Oregon, USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Partiendo de 2 µg de ARN total y utilizando

ADN complementario. De este ADN se tomaron 4 µl para su amplificación por PCR. Los cebadores utilizados para la amplicación de mRNAs se obtuvieron de Sigma-Genosys y las secuencias son:

FLIPL-sentido: 5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’ FLIPL-antisentido: 5’-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’ FLIPS-sentido: 5’-ATGTCTGCTGAAGTCATCCAT-3’ FLIPS-antisentido:5’-TCACATGGAACAATTTCCAAG-3’ Actina-sentido: 5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’ Actina-antisentido: 5’-CATGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3’

Los productos de amplificación que se producen son de 667 pb para cFLIPS, 230pb para cFLIPL y 661 pb para la actina. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 2 minutos a 94ºC, 27 ciclos de: 40 segundos a 94 ºC, 40 segundos a 60ºC y 40 segundos a 72ºC. Se finaliza con 10 minutos a 72 ºC. Los productos amplificados se visualizaron en un gel de agarosa (AppliChem) a 1% en tampón TAE con 0’5 µg/ml de bromuro de etidio (Sigma-Aldrich).

Electroporación y sorting.

Los experimentos de electroporación se realizaron basados en el protocolo descrito por Agami R. et al, Cell, 2000. Brevemente: 1.500.000 células tumorales MCF-7 se resupendieron en 100 µl de tampón de electroporación que contenía 2mM HEPES (pH 7’2), 15 mM K2HPO4/KH2PO4, 250mM Manitol y 1mM MgCl2 a un pH final de 7’2.

1µg total de ADN (0’3 µg del plámido que codifica para GFP y 0’7 µg del plásmido que codifica para una forma constitutivamente activa de AKT (pcDNA3-Myr-AKT, amablemente cedido por el Dr. Kenneth Wals) o del plásmido que codifica para una forma dominante negativa de AKT (pcDNA3-dnAKT, amablemente cedido por el Dr. Kenneth Walsh) fue

añadida a esta suspensión y transferida a una cubeta de electroporación de 0.1 cm (Sigma-Aldrich). Posteriormente las células se electroporaron en el aparato de electroporación Gene pulser II (BIORAD) con las condiciones 140 voltios, 10 pulsos, 1.5 ms de duración de pulso y un intervalo de tiempo entre pulsos de 1.5 segundos. 48 horas después de la electroporación, se seleccionaron las células positvas para GFP utilizando un citómetro FACSAria Cell Sorter (Becton Dickinson). Las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS antes de resuspenderlas en 1 ml de un tampón que contenía 5mM de EDTA y 25mM de Hepes pH 7 en PBS. Con el objetivo de evitar agregados, las células se filtraron utilizando filtros de 70 µm. Tras el proceso de selección, las células recuperadas, se lisaron y se analizaron las proteínas pertinentes mediante western-blot.

Transfección transitoria con oligos de ARN de interferencia (siRNA). El silenciamiento transitorio de proteínas celulares mediante siRNA se llevó a cabo con el reactivo de transfección Dharmafect (Dharmacon, Colorado, USA). Para ello se sembraron 250.000 células por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillo y en medio completo sin antibiótico. Al dia siguiente, el medio completo fue sustituído por 2 ml de medio de transfección durante 24, 48 o 72 horas.

El medio de transfección se compone de 10 ó 50nM de oligos, 2’5 µl de Dharmafect y 2ml de medio Optimen (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY, USA). La preparación del medio de transfección consta de dos pasos. En primer lugar se mezclan durante 5 minutos a temperatura ambiente el Dharmafect con el medio Optimen. Pasado este tiempo, se añade esta mezcla a los oligos y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. En ese tiempo, se lavan los pocillos con medio Optimen y se les añade 1’6 ml del mismo a cada pocillo. Tras los 20 minutos de incubación, se añaden 400 µl de

Producción viral.

Para la producción de retrovirus y lentivirus, se utilizó la línea celular HEK293T (amblemente cedida por el Dr. Antonio Rodríguez Márquez, CNIO, Madrid) y los siguientes plásmidos:

Plásmidos retrovirales: el plásmido pCI-VSV-G, que codifica para la expresión del gen de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), comunmente utilizada para el pseudotipaje de lentivirus y