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a. Extracción de fibra dietaria total (soluble e insoluble)

Los ajíes fueron acondicionados para la extracción secando 100 g de cada accesión a 40 ºC por tres días. Las muestras secas fueron molidas y envasadas en bolsas de polietileno de alta densidad, las mismas que fueron almacenadas en un desecador hasta su análisis.

Se pesó cuatro muestras de un gramo cada una en beackers de 400 mL. Se agregó 40 mL de buffer MES-TRIS para regular el pH a 8,2 y 50 µL de la solución de α-amilasa, agitando lentamente. Los beackers fueron cubiertos con foil de aluminio y estuvieron en baño María a 99 ºC por 35 min con agitación continua. Luego, las muestras fueron enfriadas hasta 60 ºC y con la ayuda de una espátula y 10 mL de agua destilada se raspó las porciones de muestra que quedaron adheridas al vaso. Se agregó 100 µL de solución proteasa a cada muestra, se cubrió con foil y se sometió a baño María a 99 ºC por 30 min con agitación continua. Cumplido el tiempo, los vasos fueron retirados y se agregó 5 mL de HCl 0,561 N para llegar al pH 4,5. Por último, se agregó 200 µL de solución amiloglucosidasa y se repitieron los pasos realizados con la proteasa.

Para determinar de la fibra dietaria insoluble se taró un crisol Gotche que contenía 0,1 mg de celite y se agregó 3 mL de agua destilada para distribuir todo el celite dentro del crisol. Las muestras extraídas fueron filtradas y el residuo enjuagado dos veces con 10 mL de agua destilada a 70 ºC. El líquido obtenido se transfirió a un beacker de 600 mL y el residuo se volvió a lavar, pero con 10 mL de etanol y con 10 mL de acetona. El residuo fue secado a 103 ºC durante toda la noche. Ya enfriado fue pesado y se le restó el peso del crisol y del celite. Por último, a cada residuo se le analizó la cantidad de proteína y ceniza, las cuales fueron sustraídas junto con el blanco.

Por otro lado, para determinar la fibra dietaria soluble se agregó cuatro volúmenes de etanol al 95 por ciento (60 ºC) al líquido obtenido en el beacker de 600 mL en la etapa previa. Luego se taró un crisol Gotche con 0,1 mg de celite (que fue distribuido homogéneamente agregando 15 mL de etanol al 78 %). El líquido se filtró y el residuo se lavó con 15 mL de etanol al 78 por ciento, 15 mL de etanol al 95 por ciento y 15 mL de acetona. La torta se dejó secando a 103 ºC por toda la noche. Para la determinación de la fibra dietaria soluble el residuo enfriado fue analizado de igual manera que para la fibra insoluble.

La determinación de proteínas se realizó usando el método de Kjeldhal, tomando 6,25 como factor para calcular los gramos de proteína y la determinación de ceniza se obtuvo al incinerar el residuo por cinco horas a 525 ºC, restando el peso del crisol y el celite. El blanco contuvo todos los reactivos y siguió los mismos procedimientos solo que no se agregó la muestra de ají seco (al blanco también se le midió y restó la cantidad de proteína y ceniza). Por último, el contenido de fibra dietaria total fue la suma de la fibra dietaria soluble e insoluble.

b. Determinación del contenido de sustancias pécticas

Las sustancias pécticas fueron cuantificadas como ácido galacturónico en función al material insoluble en alcohol (GalA/AIR por sus siglas en inglés) según lo descrito por Christiaens et al. (2012) con ligeras modificaciones. Para las accesiones de ají, se elaboró una pasta base de ají y agua destilada en las proporciones 1:1 (p/p). Para ello se licuó por 20 s a velocidad baja y 40 s a velocidad alta. Para separar los componentes de la pared celular, aproximadamente 30 g de salsa de ají (o pasta base de ají) se homogenizaron en 192 mL de etanol (95% v/v) utilizando una licuadora. La suspensión fue filtrada (papel filtro de paso rápido) y el residuo se rehomogenizó en 96 mL de etanol (95 % v/v). Luego se realizó una segunda filtración cuyo residuo se homogenizó en 96 mL de acetona. El resultado de esta última filtración fue el residuo insoluble en alcohol, el cual fue secado durante 20 horas a 40 ºC. El AIR fue molido y almacenado en bolsas de polietileno dentro de un desecador hasta su uso.

Para la determinación del ácido galacturónico (GalA, por sus siglas en inglés) se siguió el método descrito por Ahmed y Lavabitch (1977). Una muestra de AIR (5 mg aproximadamente) fue pesada en un beacker de 20 mL. Se agregaron dos mL de ácido sulfúrico concentrado (enfriado) y se mezcló suavemente. El beacker fue sometido a un baño de agua helada sin detener la agitación. Luego se agregó 0,5 mL de agua destilada (gota a gota) continuando con la agitación suave. Se siguió agitando por 5 min hasta que la pared celular se comenzó a disolver. Después se agregaron otros 0,5 mL de agua destilada y se mantuvo en un agitador magnético (15 000 rpm por una hora). La muestra disuelta se transfirió a una fiola volumétrica de 20 mL (se enjuagó varias veces el beacker con agua

Para determinar el contenido de ácidos urónicos se agregó una alícuota de 0,6 mL de la disolución a los tubos de ensayo que habían sido enfriados previamente en un baño de agua helada. Luego se agregaron 3,6 mL de tetraborato de sodio (0,0125 M) en ácido sulfúrico concentrado y se mezcló en un vórtex. Después se calentaron los tubos en agua baño maría en agitación (99 ºC por 5 min), se enfriaron un baño con agua helada y se adicionaron 60 µL de m-hidroxifenil (meta hidroxifenil o m-fenilfenol). Inmediatamente se mezcló con la ayuda del vórtex (8 000 rpm por 1 min) y se leyó la absorbancia a 520 nm luego de un minuto. Las correcciones debido al ligero color rosa producido al someter los azúcares no reductores a altas temperaturas junto con el tetraborato de sodio en ácido sulfúrico se realizaron mediante un blanco de 60 µL de NaOH (0,5 %) en vez de agregar m-hidroxifenil. La absorbancia del blanco se restó de la absorbancia total.