Literature Implications

Tomando las distintas fases del protocolo como puntos de análisis se comenzó a estudiar la primera fase del cultivo en suspensión. Mediante el análisis de las muestras bajo un microscopio electrónico de transmisión (MET) se definieron las características morfológicas de las células (Figura 6.3). A las pocas horas de cultivo tras el aislamiento de las células se observaron por un lado, células con cuerpos blancos y más retículo endoplásmico rugoso (RER) que una célula muscular (Figura 6.3 A), y por otro lado, células con una ultraestructura similar a la de las células madre del músculo, coincidiendo en el aspecto del citoplasma, en la forma de las mitocondrias y en las características del núcleo (Figura 6.3 B). Además, en algunas de estas células se detectó una estructura alargada identificada como cilio primario (Figura 6.3 B, recuadro), indicativo tal vez de un estado no proliferativo de las células, y se observó cómo este tipo de células establecían uniones entre sí (Figura 6.3 C). Al analizar las muestras cultivadas durante 7 días en suspensión se encontraron esferas con heterogeneidad de tipos celulares (Figura 6.3 D). A mayores aumentos se distinguían células tipo fibroblasto (Figura 6.3 E, asterisco blanco y F) con numerosas vacuolas, abundante RER, citoplasma muy electrodenso con pocas mitocondrias distribuidas de manera uniforme, contorno celular irregular y núcleos irregulares con abundante heterocromatina. Esta morfología contrastaba con la de otras células que presentaban menos vacuolas y menos RER (Figura 6.3 E, asterisco negro). Estas podrían ser células miogénicas y correspondían aproximadamente al 10-15% de la población total de la esfera. Contenían abundantes mitocondrias preferentemente concentradas en las proximidades del núcleo (Figura 6.3 G), un núcleo con menos heterocromatina y con un contorno más redondeado que el de las células anteriormente descritas (Figura 6.3 E, asterisco negro). Asimismo, en estas células se encontraron filamentos de actina y miosina que habían

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comenzado a organizarse cortados transversalmente (Figura 6.3 H, línea de puntos) y también en cortes longitudinales (Figura 6.3 I, flechas), evidenciando un estado temprano de diferenciación de las células ya en estas condiciones de cultivo no adherentes.

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Figura 6.3. Secciones ultrafinas analizadas a través del MET del cultivo en suspensión a día 0 (A-C) y a los 7 días (D-I). (A) Célula con características morfológicas de fibroblasto. (B) Célula con características morfológicas similares a las de la

célula madre del músculo, el recuadro señala el cilio primario. (C) Uniones entre células de aspecto miogénico. (D) Heterogeneidad celular de una esfera. (E) Dos tipos celulares distintos presentes en las esferas, el asterisco blanco identifica a una tipo fibroblasto y el asterisco negro a una parecida a una célula miogénica. (F) Célula fibroblástica con abundante RER. (G) Detalle de las mitocondrias de una célula tipo miogénica. (H-I) Presencia de filamentos de actina (delgados) y miosina (gruesos) en las células miogénicas, cortados de forma transversal señalados con la línea de puntos (H) y cortados de forma longitudinal señalados con las flechas (I). Las barras de tamaño representan 1 μm en los paneles A-C y G, 2 μm en el panel F, 6 μm en el panel E, 20 μm en el panel D, 200 nm en el panel H y 500 nm en el panel I.

Aunque el estudio morfológico y ultraestructural de las muestras durante el cultivo en suspensión indicaba la presencia de una subpoblación discreta de células similares a las células miogénicas o musculares, se analizó si la expresión y regulación génica durante esta fase también concordaba con la expresión de genes identificativos de poblaciones miogénicas y relevantes para la determinación y el desarrollo miogénico (Figura 6.4). Tomando como puntos clave de análisis el comienzo (día 0) y el final (día 7) de esta fase, comparativa que reflejaría la evolución de estas células, a través de una RT-qPCR se vio que los genes miogénicos de expresión temprana Pax7 y

MyoD1 se expresaban más al inicio que al final del cultivo, si bien los valores de su expresión

resultaban ser bajos en general (Figura 6.4 A-B). Se observó que la expresión del gen MyH2 también era más alta a día 0 que a día 7 (Figura 6.4 E), tal vez por la presencia de restos tisulares al comienzo del cultivo, ya que se considera una miosina de expresión tardía. A diferencia de estos genes, la expresión del factor de transcripción Miogenina conocido por su papel en la inducción y desarrollo de la miogénesis, y del gen MyH3, una miosina presente en la embriogénesis y en el desarrollo temprano de los músculos, fue mayor a día 7 que al comienzo del cultivo, aunque con cierta variabilidad en el grado de su expresión entre las muestras provenientes de distintos ratones (Figura 6.4 C-D).

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Figura 6.4. Cuantificación de la expresión de determinados genes miogénicos a día 0 y a día 7 del cultivo en suspensión

por RT-qPCR. Se analizó la expresión de los genes Pax7 (A), MyoD1 (B), Miogenina (C), MyH3 (D) y MyH2 (E). En todos los casos se muestran los valores obtenidos de muestras provenientes de tres ratones distintos y se representan relativizados a la expresión del gen endógeno Tbp.

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Conjuntamente, a día 7 de cultivo se analizó la expresión de genes implicados en la miogénesis a través de la expresión de genes reportero regulados bajo el promotor del gen de interés (Figura 6.5 A-B). Con esta técnica, la detección de las proteínas codificadas por los genes reporteros muestra indirectamente la expresión de un gen concreto. Partiendo de la biopsia de piel dorsal de un ratón transgénico con estos constructos se apreciaron células positivas para fosfatasa alcalina (Figura 6.5 A) y β-gal (Figura 6.5 B), equivalentes a la expresión de los factores reguladores miogénicos Mrf4 y Myf5 respectivamente.

Asimismo, como parte determinante para el estudio de la naturaleza de las células presentes en el cultivo en suspensión se analizó la expresión de diversas proteínas miogénicas por

Western blot (Figura 6.5 C-D). A día 0 del cultivo se detectaron proteínas miogénicas tales como

PAX7, MYOD1, MIOGENINA y MYHC (todas las isoformas), indicando la presencia de células musculares al comienzo del cultivo. Al cabo de 7 días sólo se detectaron MYHC y la MYH3. Para corroborar la ausencia de expresión de algunas proteínas miogénicas a día 7, estas se detectaron a través de técnicas de inmunofluorescencia (Figura 6.5 E-H). Al contrario que en el Western blot, las proteínas miogénicas MYOD1 y MIOGENINA se detectaron claramente dentro de las esferas (Figura 6.5 E-F), así como las proteínas MYHC y SERCA-1 (Figura 6.5 G-H), marcando en todos los casos solo a unas pocas células dentro de las esferas. Esta discrepancia en los resultados puede deberse a la distinta sensibilidad de las técnicas empleadas.

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Figura 6.5. Expresión de genes y proteínas miogénicas en el cultivo en suspensión. (A-B) Tinción de color azul para la

detección de la fosfatasa alcalina relativa a la expresión del gen Mrf4 (A) y de la β-gal relativa a la expresión del gen

Myf5 (B) en muestras procedentes del ratón transgénico B195APZ. (C-D) Análisis de la expresión proteica de PAX7,

MYOD1 y MIOGENINA (C) y de MYHC (todas las isoformas) y MYH3 (embrionaria) (D) por Western blot a día 0 y a día 7 en 3 muestras independientes y en el músculo esquelético (control positivo), utilizando el GAPDH como control de carga. (E-H) Detección de las proteínas miogénicas MYOD1 (E), MIOGENINA (F), SERCA-1 (G) y MYHC (todas las isoformas) (H) por inmunofluorescencia (verde) con los núcleos teñidos con Hoechst (azul). Las barras de tamaño representan 100 μm en los paneles A, B, E, F, G y H.

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Prosiguiendo con la caracterización según las fases del protocolo del cultivo se analizó el cultivo en condiciones adherentes, centrándose en los cambios morfológicos y de expresión génica y proteica.

El efecto en la estructura celular por la adhesión a un sustrato rico en proteínas de la matriz extracelular se apreció a través del análisis por MET. Tras 2 días de cultivo (Figura 6.6 A-C) se seguían distinguiendo unas células con vacuolas, extenso RER (Figura 6.6 A, asteriscos blancos y B) y además, con fibras de colágeno extracelulares próximas (Figura 6.6 A, flechas), con lo que se confirmaba la presencia de fibroblastos; y por otro lado se observaron células alargadas que presentaban dos o más núcleos que claramente correspondían a células miogénicas en diferenciación (Figura 6.6 A, asteriscos negros). Además, estas células habían comenzado a adoptar características propias de los miotubos: sus mitocondrias se hallaban alineadas en paralelo (Figura 6.6 C, flechas negras), y al observar en detalle su citoplasma se encontraron haces de actina y miosina cortados longitudinalmente que habían empezado a organizarse en forma de sarcómeros (Figura 6.6 C, flechas blancas). A los 7 días de cultivo se podían apreciar claramente células miogénicas perfectamente diferenciadas formando miotubos (Figura 6.6 D), donde se observaban de forma nítida las miofibrillas organizadas en sarcómeros, distinguiéndose en ellas las características bandas A e I y las líneas Z y M (Figura 6.6 E, flechas blancas), y las mitocondrias alargadas ubicadas a lo largo de estas estriaciones, típicas de las fibras de músculo esquelético (Figura 6.6 E, flechas negras). Mediciones repetidas mostraron que los sarcomeros medían entre 1,5-3,3 μm de largo, las bandas A entre 1-2 μm, las bandas I entre 0,5-1,3 μm, las fibras de actomiosina tenían un grosor de entre 0,3-0,6 μm y las fibras presentaban un diámetro aproximado de 40 μm.En cortes transversales, estos haces organizados de miofibrillas formaban agrupaciones punteadas (Figura 6.6 F, flechas negras) alrededor de las cuales se distribuían las mitocondrias (Figura 6.6 F, flechas negras). También se observaron muchas caveolas en la membrana plasmática de estos miotubos, típicas vesículas que se encuentran en las células musculares, aunque son más frecuentes en el músculo liso (Figura 6.6 G, flechas negras). En lo relativo a los contactos entre célula-célula, se advertían pequeñas uniones adherentes (Figura 6.6 H, flechas blancas) y se encontró una unión de tipo GAP (Figura 6.6 I, flecha blanca).

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Figura 6.6. Secciones ultrafinas (A-C y E-I) y un corte semifino (D) del análisis a través del MET del cultivo en adhesión a

día 2 (A-C) y a los 7 días (D-I). (A) Identificación de distintos tipos celulares como fibroblastos marcados con asteriscos