Research Strategy

Los análisis por citometría de flujo se realizaron en colaboración con la Plataforma de Citometría y Microscopia Óptica Avanzada de Inbiomed (Donostia - San Sebastián), dirigida por María Paz López Mato.

Se realizaron diversos análisis de células cultivadas en condiciones no adherentes mediante la técnica de citometría de flujo. Dado que en este procedimiento las células suspendidas en un fluido son analizadas de una en una mientras atraviesan un finísimo tubo sobre el que incide un rayo de luz láser es necesario eliminar los agregados y demás restos celulares que puedan interferir en el estudio. Por ello, las células o las esferas celulares fueron disociadas con 1 mL de solución de Tripsina-EDTA 0,25% durante 5-7 minutos a 37○

C, que se inactivó diluyendo y lavando a su vez con PBS (pH 7,2) para luego filtrar la solución a través de un filtro para células de 70 μm. Seguidamente se centrifugó durante 5 minutos a 1500 rpm para resuspender el pellet en 1 mL de tampón de separación (PBS 1X sin Ca2+ ni Mg2+ con 0,5% de BSA, HEPES 25 mM y EDTA 5 mM pH 7,2), pasarlos a Tubos Falcon® de poliestireno de 5 mL y contar el número de células en el Automated Cell Counter TC20™ (BioRad). En el presente trabajo esta técnica se utilizó para analizar la expresión de genes reportero de proteínas fluorescentes. Los ensayos en los que se analizó la proteína EYFP se realizaron en un citómetro BD FACSCantoA (BD Biosciences) utilizando el láser de excitación azul y recogiendo las señales fluorescentes emitidas con el filtro de paso de banda 530/30. En cambio, los datos sobre las proteínas GFP, EGFP y Tomato o RFP fueron adquiridas en un separador celular BD FACSAria III (BD Biosciences) utilizando los láseres de excitación azul y amarillo-verde y recogiendo las señales fluorescentes emitidas con los filtros de paso de banda 530/30 y 610/20 respectivamente. La adquisición de los datos se gestionó a través del software BD FACSDiva™ adquiriendo un mínimo de 10.000 eventos en la región de análisis, excluyendo los agregados y las células no viables (señal positiva de TO-PRO®-3 Iodide o de 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), teniendo en cuenta la auto-fluorescencia (naranja) emitida por las células y utilizando células que no expresaban el gen reportero como control para ajustar los parámetros en cada caso. Los parámetros de dispersión se adquirieron en modo lineal, mientras que los parámetros de fluorescencia se establecieron en modo logarítmico. Los datos se analizaron con los software BD

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FACSDiva™ y FlowJo, y se representaron en gráficas de puntos mostrando la fluorescencia a estudiar versus la auto-fluorescencia de las células.

5.7.5.13.1 BD Lyoplate™ Mouse Cell Surface Marker Screening Panel

La citometría de flujo también se aplicó al estudio masivo de marcadores celulares de superficie gracias al BD Lyoplate™ Mouse Cell Surface Marker Screening Panel, que contiene 176 anticuerpos específicos para diferentes marcadores celulares de superficie y diversos controles ubicados de manera individual en los pocillos de 3 placas de 96 pocillos, permitiendo la clasificación de poblaciones celulares diferentes. La información detallada sobre los marcadores estudiados se encuentra en las Tablas 5.7 y 5.8 y en el Anexo I.

Como se ha descrito anteriormente, las células a analizar se disgregaron con 1 mL de solución de Tripsina-EDTA 0,25% durante 5-7 minutos a 37○

C, que se inactivó diluyendo y lavando a su vez con PBS (pH 7,2) para luego filtrar la solución a través de un filtro para células de 70 μm. Seguidamente se centrifugó durante 5 minutos a 1500 rpm para resuspender el pellet en 1 mL de PBS (pH 7,2) y contar el número de células en el Automated Cell Counter TC20™ (BioRad). Se dispusieron entre 500.000-1.000.000 de células en un volumen final de 50 μL por pocillo, por lo que el pellet correspondiente al número total de las células a repartir se resuspendió en el volumen total correspondiente de la solución de bloqueo de PBS (pH 7,2) al 10% de FBS, dejándolas durante 15 minutos a RT, para luego poner 50 μL por pocillo de la suspensión celular en 3 placas nuevas de 96 pocillos. Se añadieron 10 μL por pocillo de los anticuerpos primarios y controles de isotipos previamente reconstituidos a una concentración de 0,025 μg/μL en cada pocillo correspondiente y se incubaron durante 20-30 minutos a 4○

C. Se añadieron 120 μL de tampón de tinción (PBS 1X sin Ca2+ ni Mg2+ con 3% de BSA, 0,09% de azida de sodio y EDTA 5 mM) por pocillo, se centrifugaron las placas durante 5 minutos a 300 g y se volvieron a lavar con 200 μL de tampón de tinción centrifugando de la misma manera. Se añadieron 50 μL de los anticuerpos secundarios conjugados con biotina a la dilución adecuada y a los pocillos correspondientes y se incubaron durante 20-30 minutos a 4○

C y en oscuridad. Después de dos lavados con 100 μL y 200 μL por pocillo de BSA centrifugando durante 5 minutos a 300 g, se añadieron 100 μL del reactivo terciario, la Estreptavidina Alexa FLuor® 647 diluido a 1:4000, y se incubaron durante 20-30 minutos a 4○

C y en oscuridad. Se realizaron varios lavados con BSA igual que antes y para finalizar, el pellet celular de cada pocillo se resuspendió en 150 μL de tampón de tinción y se pasó a Tubos Falcon® de

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polipropileno de 5 mL para analizarlos en la máquina de separación celular BD FACSAria III (BD Biosciences), para así también poder detectar a la vez la expresión de genes reportero de proteínas fluorescentes. Se adquirieron como mínimo 20.000 eventos por pocillo. Los datos fueron confirmados por la repetición en serie de todos los pocillos con resultado positivo y fueron controlados por una serie de pocillos con resultado negativo conocido. Unas pocas células sobrantes se utilizaron para ajustar la auto-fluorescencia y determinar la viabilidad celular (señal negativa de 7-AAD) a la hora de analizar los datos con la ayuda del software BD FACSDiva™ y FlowJo.

5.7.5.13.2 Separación celular por fluorescencia

Por otro lado, esta técnica de análisis se aplicó a la clasificación y selección de células con características particulares de dispersión y fluorescencia provenientes de una mezcla de varias poblaciones celulares, realizándose en este trabajo dos tipos de separación celular por fluorescencia; en base a la proteína fluorescente que las mismas células expresaban y en base a la expresión de proteínas de superficie marcadas con anticuerpos fluorescentes.

En el primer caso, la separación celular se realizó a través de la detección de la fluorescencia de proteínas como EYFP, GFP, EGFP, Tomato y RFP. Las células se prepararon y se analizaron tal y como se ha descrito previamente en el apartado 5.6.4.13, pero pasándolas a tubos Falcon® de polipropileno de 5 mL, y se separaron en poblaciones consideradas positiva o negativa en base a si las células expresaban o no la proteína fluorescente.

En el segundo caso, se realizó un marcaje directo de proteínas de superficie con anticuerpos primarios conjugados. El procedimiento inicial fue el mismo que antes, las células a analizar se disgregaron con 1 mL de solución de Tripsina-EDTA 0,25% durante 5-7 minutos a 37○

C, que se inactivó diluyendo y lavando a su vez con PBS (pH 7,2) para luego filtrar la solución a través de un filtro para células de 70 μm. Seguidamente se centrifugó durante 5 minutos a 1500 rpm, se resuspendió el pellet en 1 mL de PBS (pH 7,2) para contar el número de células en el Automated Cell Counter TC20™ (BioRad) y estimar el volumen necesario para la distribución de un número concreto de células en los diferentes tubos de ensayo. Se necesitaban 100.000 células sin marcar como control de la auto-fluorescencia, 100.000 células con el isotipo control para medir la señal inespecífica, 100.000 células con la tinción para ajustar los parámetros y por último el tubo

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experimental con el resto de células teñidas para realizar la separación de las poblaciones celulares. Por lo tanto, las células se volvieron a centrifugar durante 5 minutos a 1500 rpm para resuspenderlas en el volumen calculado de solución de bloqueo de PBS (pH 7,2) al 1% de BSA y al 10% de FBS, distribuir la cantidad necesaria en los diferentes tubos de ensayo y dejarlas durante 10 minutos a RT. Seguidamente se añadieron el isotipo y el anticuerpo primario conjugados a los tubos correspondientes y se incubaron durante 30 minutos a 4○

C agitando los tubos cada 10 minutos. Tras esta incubación se añadieron 2 mL por tubo de PBS (pH 7,2) al 1% de BSA para lavar, se centrifugó durante 5 minutos a 1500 rpm y a 4○

C y se volvió a lavar con otros 2 mL. El pellet de los tubos con 100.000 células se resuspendió en 100 μL de PBS (pH 7,2) al 1% de BSA y el pellet del tubo con las células a separar se resuspendió en 100 μL por cada 2.000.000 de células. Inmediatamente, se añadió el reactivo Estreptavidina APC a cada tubo y se incubó durante 30 minutos a 4○

C y en oscuridad, agitando los tubos cada 10 minutos. Pasado este tiempo se realizaron los mismos lavados que antes y el pellet final se resuspendió en tampón de separación y se pasó a tubos Falcon® de polipropileno de 5 mL para analizarlos en la máquina de separación celular BD FACSAria III (BD Biosciences). En algunos casos se realizó una separación doble teniendo en cuenta, además del marcaje descrito, la expresión de proteínas fluorescentes por las propias células. El procedimiento se realizó excluyendo agregados y células no viables (señal positiva de 7-AAD o de tinción verde SYTOX®) y los datos se analizaron con el software BD FACSDiva™ y FlowJo.

Los anticuerpos y reactivos utilizados con sus diluciones concretas se detallan en las Tablas 5.9 y 5.10.