3 (LOWER), WHERE 3 REPRESENTING 30% OF THE STRAIN AT

amonio

4.2.1. Respuesta de líneas transformadas en brotes in vitro

Los brotes in vitro de las ocho líneas transgénicas de las tres construcciones utilizadas

(pHCA58, pHCG59 y pHGA91) que portan como marcador de selección el gen bar no

presentaron resistencia frente a la concentración de 3,0 mg.l-1 _{glufosinato de amonio}

(concentración mínima inhibitoria).

El 100 por ciento de los brotes presentaron grado de afectación cuatro según escala propuesta en el presente trabajo (Figura 8).

Resultados y Discusión

47 Figura 8. Aspecto de los brotes in vitro de banano cv. Grande naine (AAA) con grado cuatro de afectación en medio selectivo con 3,0 mg.l-1 _{de glufosinato de amonio de líneas transgénicas} de las tres construcciones utilizadas a los 30 días de cultivo. A) pHCA58-Línea 4, B) pHCG59- Línea 1, C) pHGA91-Línea 17, D) Control

Esta respuesta de las líneas transformadas pudiera estar relacionada con posibles escapes durante el proceso de selección del cual estas provenían. Otro elemento que pudiera influir en esta respuesta es que estas líneas fueron expuestas a largos períodos de cultivo in vitro y en campo que esto pudo motivar la escisión de los transgenes del genoma del banano. Resultados similares fueron descritos por Matsumoto et al. (2007) en líneas de banano cultivar Maca (AAB) transformadas las cuales no expresaron resistencia al agente selectivo después de un período de cuatro años de multiplicación in vitro y en campo, encontraron que cuatro de las seis líneas que estudiaron no expresaron resistencia al agente selectivo. Estos autores plantearon como posible causa la inestabilidad genética del genoma triploide de banano durante el proceso de micropropagación. Por otro lado, varios autores (Lazzin et al., 2000;

Eady, 2000 y Raman et al., 2007) plantearon la necesidad de utilizar medios de selección

adecuados que eliminen de forma efectiva el explante no transformado.

D) C)

B) A)

Resultados y Discusión

48 4.2.2 Respuesta de líneas transformadas en casa de cultivo

En este experimento los resultados fueron similares al obtenido en el acápite 4.2.1 al aplicar glufosinato de amonio a la concentración de 30,0 g.l-1 _{a las ocho líneas transformadas. A los} 30 días todas las plantas tenían grado de afectación cuatro que se correspondió con la necrosis total de la planta según la escala elaborada en el presente trabajo y presentada en el acápite 4.1.3 (Figura 9).

Figura 9. Plantas de banano cv. Grande naine (Musa spp. AAA) en casa de cultivo después

de 30 días de aplicado el herbicida glufosinato de amonio a la concentración de 30,0 g.l-1 _A) Control negativo con grado cuatro de afectación, B) Planta de línea transformada con grado cuatro de afectación, C) Control positivo sin aplicarle el herbicida.

las líneas transformadas de las distintas construcciones no fueron positivas al análisis de PCR demostrando que no estaba integrado en su genoma ADN el transgen, al no obtenerse banda alguna (Figura 10).

Resultados y Discusión

49 Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa 1.5% (p/V) del producto de la RCP con los cebadores bar 3’ y bar 5’. Carriles 1-8: líneas transgénicas pHCA58 - Líneas (4-25-27), pHCG59 - Líneas (1-16-48), pHGA91 2 Líneas (17-23), Carril 9: control no transformado, Carril 10: control positivo, plasmidio pHCA58, Carril 11: control de contaminación, agua. Carril 12: Marcador de peso molecular O´RangeRuler 200bp (Fermentas)

Como se muestra en la figura (10) en ninguna de las líneas seleccionadas fue posible

amplificar el gen bar (Carriles 1-8), en el caso del control positivo (plasmidio pHCA58) se

amplificó una banda de 402 pb, la cual coincide con la talla esperada para este gen.

Estos resultados se corroboran con los obtenidos en los experimentos anteriores, donde estas líneas se mostraron sensibles al glufosinato de amonio. En análisis moleculares realizados a algunas de estas líneas (Bermúdez 2006) todas habían resultado positivas a la presencia del gen bar por PCR y algunas de ellas lo fueron a Southern blot, multiplicadas durante cuatro a cinco ciclos en campo y posteriormente un año in vitro para un total de casi seis años.

En este caso hay tres posibles causas, primero la exposición a largos períodos de subcultivos

in vitro que motivó la escisión de los transgenes del genoma del banano. En la literatura se ha descrito la inestabilidad genética de los bananos durante los procesos de micropropagación

(Côte et al., 1998). En condiciones inestables el transgén podría ser preferencialmente

eliminado por algún tipo de regresión de mutación o por el sistema de reparación de errores (Leonard et al., 2003). Este fenómeno fue descrito por Matsumoto et al., (2007) en plantas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

200 pb 400 pb 600 pb

Resultados y Discusión

50

transgénicas de banano cultivar Maçã (Musa AAB), en el estudio de seis líneas, cuatro

mostraron la pérdida del transgén en 17 a 100% de la población de plantas probadas, después de cuatro años de propagación vegetativa y mantenimiento. Algunos autores sugieren que la inestabilidad genética impuesta por las condiciones de estrés causado durante el cultivo de

tejidos es el responsable de la pérdida del transgén. En plantas transgénicas de Nicotiana

tabacun y N. plumbaginifolia se mantuvo la estabilidad del T-ADN durante el desarrollo de la

planta, sin embargo, este se mostró inestable durante la propagación por callos (Risseeuw et

al., 1997).

La segunda causa pudo estar dada por la existencia de plantas quiméricas, las cuales fueron escindiendo la parte transgénica durante los procesos vegetativos de propagación. La tercera causa pudo ser que algunas de las líneas no fueran realmente transgénicas, y que los análisis por RPC previamente realizados hayan estado contaminados con el transgén. En la mayoría de los casos, estos no fueron confirmados por Southern blot.

4.3. Evaluación de la respuesta de nuevas líneas transformadas que portan el plasmidio