3.4 Conclusion
4.1.3 Malicious Networks Analysis
Se intentó el aislamiento y cultivo de los ejemplares coleccionados. Todas los procedimientos se realizaron asépticamente en cámara de flujo laminar horizontal. Se emplearon distintos medios de cultivo. La incubación se realizó a 4ºC, 18ºC y 25ºC, con fotoperiodo 12-12, en oscuridad total o con luz ambiente.
7.1. Técnicas de aislamiento
DIRECTO: bajo lupa se tomaron esporas o cuerpos fúngicos enteros con un ansa estéril y se colocaron sobre el medio de cultivo estéril.
DIRECTO CON ESTERILIZACIÓN: los cuerpos fúngicos o esporas se colocaron en etanol 95%. Se retiraron rápidamente y se enjuagaron con agua estéril. Luego se pasaron directamente a hipoclorito de sodio al 5%. Finalmente se enjuagaron nuevamente con agua estéril para su siembra en medio de cultivo estéril.
CORTE A LUPA Y EXTRACCIÓN EN M.O.: bajo lupa se realizaron cortes de los cuerpos fúngicos con una hoja de afeitar, se montaron en agua estéril y en el microscopio se tomaron las esporas con un ansa estéril.
MONOSPÓRICO: se colocaron 3 gotas de agua estéril sobre un portaobjetos esterilizado al fuego. Se tomaron esporas con un ansa estéril directamente del sustrato y se colocaron sobre una de las gotas. Observando con el microscopio óptico se tomó la menor cantidad de esporas posibles con una pipeta Pasteur estéril (con la punta afinada al fuego) y se las colocó en la segunda gota. Este procedimiento se repitió con una nueva pipeta Pasteur estéril de la segunda a la tercera gota. De esta última gota, con una nueva pipeta se realizó el aislamiento de una única espora.
DILUCIONES: se tomaron esporas con el ansa desde la muestra y se colocaron en un tubo de ensayo con agua estéril o con Tween 80 (0.05%= 100 ml agua estéril + Tween 80 0.5%). Se agitó para separar. Se volcó la mitad del contenido del tubo en una caja con medio de cultivo estéril y se diluyó la otra mitad con agua estéril hasta completar el volumen original. Este último paso se repitió dos veces. Las cajas sembradas se dejaron media hora tapadas, luego se abrieron y se tiró el agua sobrenadante. Se cerraron con parafilm y se guardaron invertidas.
35 TÉCNICA DE GOH (Goh, 1999):
1. Preparación de las pipetas: se colocaron dos pipetas Pasteur con sus puntas enfrentadas sobre el fuego de un mechero de alcohol y cuando el vidrio de ambas se fundió en uno solo, se tiró desde los extremos opuestos de ambas para separarlas y así sus puntas unidas se estiraron y afinaron hasta el punto en que se cortaron.
2. Se tomaron esporas en forma directa desde la muestra y se colocaron en una caja de Petri con agar agua al 3%.
3. Con las pipetas preparadas se hicieron rodar las esporas en el agar agua para separarlas y liberarlas de cualquier suciedad que pudiera estar adherida a las paredes.
4. Se tomó cada una de las esporas con un cuadradito del agar agua y se sembraron sobre un medio nutritivo.
7.2. Técnicas de escarificación e inducción de la germinación de esporas
VORTEX: las esporas tomadas directamente de la muestra con un ansa estéril se colocaron en tubos de ensayo con 100 ml de agua estéril y Tween 80 0.5% y se pasaron por vortex 2-5 minutos (Vortex PRECYTEC).ULTRASONICADO: las esporas tomadas directamente de la muestra con un ansa estéril se colocaron en eppendorfs con agua estéril y se aplicaron distintos tiempos de ultrasonicado: 2 ó 4 minutos (Ultrasonicador BRASONIC 5).
LUZ UV: las cajas sembradas se expusieron a tratamientos de 10, 15 o 30 minutos o “shock” de 24 horas de luz ultravioleta proporcionada por una lámpara de pie.
PRESION DE VAPOR: las cajas sembradas se expusieron a tratamientos de 1.5, 2 y 5 minutos de presión de vapor lograda mediante agua a punto de ebullición colocada en un recipiente cerrado.
7.3. Medios de Cultivo
AGAR AGUA (3%): 30 g de agar en 1000 ml de agua destilada. Esterilización:25 minutos.
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AGAR AVENA (OM): 30 g de avena arrollada comercial y 15 g de agar en 1000 ml de agua destilada. Esterilización: 20 minutos.
AGAR DEXTROSA-EXTRACTO DE LEVADURA (DMY): 10 g de dextrosa, 5 g de extracto de malta, 5 g de extracto de levadura y 20 g de agar en 1000 ml de agua destilada. Esterilización: 20 minutos.
AGAR EXTRACTO DE MALTA (MEA): 20 g de extracto de malta, 20 g de dextrosa y 20 g agar en 1000 ml de agua destilada. Esterilización: 20 minutos.
AGAR EXTRACTO DE NOTHOFAGUS: 170 ml de extracto de Nothofagus* (filtrado) y 10 g de agar en agua destilada hasta completar 500 ml de volumen. pH: 5. Esterilización: 20 minutos.
AGAR EXTRACTO DE NOTHOFAGUS GLUCOSADO: 170 ml de extracto de Nothofagus* (filtrado), 5 g de glucosa y 10 g de agar en agua destilada hasta completar 500 ml de volumen. pH: 6. Esterilización: 20 minutos.
*Extracto de Nothofagus: 7 g de trocitos de madera de Nothofagus dombeyi
en 200 ml de agua destilada. Esterilización: 15 minutos. El extracto obtenido se conservó en heladera hasta su uso.
AGAR GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA (YGC): 5 g de extracto de levadura, 20 g de glucosa, 0,1 g de cloramfenicol y 15 g agar en 1000 ml de agua destilada. Esterilización: 20 minutos.
AGAR MALTA-LEVADURA (MYE): 10 g de extracto de malta, 2 g de extracto de levadura y 20 g de agar en 1000 ml de agua destilada. Esterilización: 20 minutos.
AGAR PAPA GLUCOSADO (APG): 300 g de papas peladas, 10 g de glucosa, 20 g de agar en 1000 ml de agua destilada. Cortar las papas en trozos y hervirlas entre 50 y 60 minutos, filtrar y llevar a volumen con agua destilada, agregar el agar y fundir a baño maría. En caliente agregar la glucosa y disponer en tubos o cajas de Petri. Esterilización: 20 minutos.
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MEDIO SINTÉTICO DE KAUFFMAN: 5 g de maltosa, 1 g de peptona, 0,5 g de MgSO4, 0,25 g de KH2PO4, 0,1 g de Ca(NO3)2 y 15 g de agar en 1000 ml de agua destilada. Esterilización: 20 minutos.
Para pesar cada componente se usaron balanza electrónica AND FX400 y balanza Scout Pro OHAUS.
La esterilización de los medios se realizó por calor húmedo, a una atmósfera de presión, en autoclave de Chamberland.
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