6. PPM TOOLS BENCHMARK
6.1. Meditel requirements study
DE LA MICROFLORA SUBGINGIVAL
El proceso diagnóstico no es un método perfecto que siempre relaciona el resultado de la prueba con la situación clínica real. La variedad que existe de métodos de detección de microorganismos nos obliga a comparar y evaluar cada uno para poder seleccionar el que aporte mayores beneficios.
Para su evaluación, los métodos diagnósticos han de ser comparados con un método de referencia (“gold standard”). Este método nos informa de la “verdad”, es decir, cuando la enfermedad está presente el test diagnóstico será positivo. En multitud de casos, el método de referencia más apropiado puede ser un procedimiento demasiado invasivo o demasiado costoso. Por eso, por consenso internacional, se puede utilizar un método de referencia imperfecto, siendo el mejor disponible. Esto sucede con los métodos de diagnóstico microbiológico, ya que el cultivo no es la técnica perfecta, pero al ser la más utilizada y durante más tiempo se ha convertido en el método de referencia (47;48;106;219).
El cultivo bacteriano posee varios problemas cuando es utilizado como referencia. El mayor problema es que existen bacterias en la bolsa periodontal que no pueden ser cultivadas (95) o que no sobreviven a la toma de la muestra o a su procesado. Esta incapacidad de poder cultivar todas las bacterias de las muestras puede favorecer la aparición de falsos-negativos (95). Además, la comparación de los métodos encargados de la detección de bacterias orales, tiene ciertas dificultades inherentes. Cada método mide variables totalmente diferentes: mientras el cultivo cuenta bacterias viables, otros métodos miden reacciones Ag-Ac, o incluso ADN. Este hecho conlleva imprecisiones en las comparaciones entre los diferentes métodos.
El principal requisito a cumplir por el test microbiológico ideal sería que fuera capaz de detectar todas las bacterias presentes en la muestra tomada, aún cuando se encuentren en un número pequeño, por lo tanto, deberá tener un límite de detección bajo. Este requisito conlleva implícitamente que debe acompañarse de una estrategia de toma muestra también ideal, es decir, capaz de recoger una muestra representativa de la microflora subgingival, aún cuando la especie bacteriana se encuentre en bajo número.
Además, debe ser capaz de cuantificar las bacterias presentes en la boca, estableciendo el recuento total de cada bacteria; este dato podría establecer diferentes niveles de patógenos que podrían determinar el padecimiento o no de algún tipo de periodontitis. Todo ello conllevará que debe ser un test con una sensibilidad y una especificidad cercana al 100%. Debe ser un test no invasivo, fácil de realizar y poco costoso. Si el test ideal necesitara bacterias viables para detectarlas conllevaría un gran coste económico, de medios y su eficacia dependería de las manipulaciones de la muestra. Probablemente lo más recomendable sería que pudiera detectar bacterias no viables para que las manipulaciones fueran lo más sencillas posible. Este requisito se podría cumplir utilizando las técnicas de biología molecular, pero para ello deberán ser caracterizadas todas las bacterias presentes en la cavidad oral y conocer su material genético.
La utilidad de las pruebas diagnósticas se valora en términos de su sensibilidad, especificidad y valor predictivo (110;220):
- La especificidad se refiere a la capacidad de una prueba u observación para diferenciar con claridad un padecimiento de otro. Se define como el porcentaje o la proporción de sujetos (localizaciones) con enfermedad realmente ausente que tienen una prueba negativa. Traducido al diagnóstico microbiológico, es el porcentaje de muestras negativas por el cultivo (método de referencia) que también lo son en el método de detección que se compara. El término falsos-positivos reflejará muestras negativas en cultivo pero positivas en el nuevo método.
- La sensibilidad denota la capacidad de una prueba u observación para identificar la enfermedad siempre que está presente. Se define como el porcentaje o la proporción de individuos (localizaciones) con enfermedad realmente presente que cuentan con una prueba positiva. Con terminología microbiológica nos describe el porcentaje de muestras positivas por el cultivo que son positivas también con el método de detección que se compara. El término falsos-negativos reflejará muestras positivas mediante el cultivo pero negativas con el método que se compara.
La sensibilidad y especificidad de una prueba deben ser tomadas en consideración cuando tenemos que elegir la prueba diagnóstica. Una vez realizada ésta, el clínico tiene que tomar una decisión de tratamiento. Para tal fin, el valor predictivo de una prueba posee interés especial. El valor predictivo se refiere a la probabilidad de que el resultado de una prueba (es decir, la proporción de resultados positivos verdaderos y resultados negativos verdaderos combinados) concuerden con el estado patológico. Hay dos tipos (110;220):
- El valor predictivo positivo determina la probabilidad de enfermedad de un sujeto o localización con resultados positivos en la prueba.
- El valor predictivo negativo determina la probabilidad de una situación clínica saludable en presencia de resultados negativos de la prueba diagnóstica. Es decir, la probabilidad de no padecer la enfermedad en sujetos con un resultado negativo en el test microbiológico.
El gran problema de los valores predictivos es su dependencia de la prevalencia de la enfermedad. Si la prevalencia de una enfermedad es muy baja, aún teniendo una alta sensibilidad el método diagnóstico, el valor predictivo positivo será pequeño, lo que significaría que aún teniendo el método diagnóstico positivo tendrá una probabilidad baja de padecer la enfermedad (110).
La representación y el cálculo matemático de la sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos se realiza mediante la confección de tablas de contingencia (Tabla 2, pág. 149).
Cada método diagnóstico de análisis microbiológico tiene que venir definido claramente por varios parámetros, entre ellos, el límite de detección, la sensibilidad y la especificidad.
Límite de detección
Se define como el nivel mínimo de bacterias necesario para detectar el microorganismo de interés. Cuanto más bajo sea el límite de detección de un método diagnóstico, más
probabilidad se tendrá de detectar la bacteria subgingival aún cuando se encuentre en un pequeño número. El límite de detección es diferente dependiendo del test que se considere, en cultivos varía dependiendo del tipo de medio que se utilice: en medios no selectivos el límite es 104-105 mientras que en los selectivos es de 103 (95). El menor límite de detección lo posee la PCR tiempo-real, pudiendo llegar a ser de 10 (164;168) (Tabla 3, pág. 150).
Sensibilidad y Especificidad (Tabla 4, pág. 151).
La sensibilidad varía para cada microorganismo en cada método de detección analizado. Los métodos inmunológicos poseen una sensibilidad para la detección de A. actinomycetemcomitans al compararlos con el cultivo que oscila entre un 20% obtenido con Evalusite® (131;221) a un 100% obtenido mediante la inmunofluorescencia indirecta y el inmunoanálisis fluorescente de concentrado bacteriano (121;129). Para P. gingivalis, la sensibilidad oscila entre un 52% (131;221)y un 100% (129). En cuanto a la especificidad, para A. actinomycetemcomitans oscilaba entre un 68% (129) a un 98% (131;221) y para P. gingivalis entre un 57% (129) a un 98% (131;221). Gracias al uso de anticuerpos monoclonales se consigue esta alta especificidad. No solo se han comparado los métodos inmunológicos con el cultivo, también se ha comparado la utilidad diagnóstica de la inmunofluorescencia indirecta con las sondas de ADN para la detección de P. gingivalis y T. forsythensis, mostrando una mayor sensibilidad que las sondas de ADN (222). Los métodos enzimáticos (BANA-test) se han comparado con cultivo, con inmunofluorescencia indirecta, ELISA y sondas de ADN mostrando resultados similares de sensibilidad (143).
Las sondas completas de ADN han mostrado diferentes resultados en los estudios realizados in vitro e in vivo. Se ha señalado, in vitro, que este tipo de sondas posee una sensibilidad y una especificidad de un 96% y un 86%, respectivamente, para A. actinomycetemcomitans, y un 60% y 82%, respectivamente, para P. gingivalis (223). Sin embargo, cuando se han analizado en pacientes, la sensibilidad y especificidad se han reducido de forma significativa, bajando la sensibilidad y la especificidad a un 21% y un 83% respectivamente, para A. actinomycetemcomitans y un 71% y 53% respectivamente para P. gingivalis (224). Este descenso puede ser debido a las reacciones cruzadas con otras especies desconocidas. Han obtenido mejores resultados
las sondas de ADN que utilizan oligonucleótidos con una sensibilidad del 100% para A. actinomycetemcomitans y P. intermedia y un 91% para P. gingivalis (153).
La PCR cualitativa comparada con el cultivo ha demostrado una mayor precisión en la identificación y la frecuencia de detección para A. actinomycetemcomitans y P. gingivalis (225). La PCR cualitativa utiliza diferentes cebadores como el gen 16 ARNr, gen fimbrias y gen colagenasa prtC. Los datos obtenidos en cuanto a la sensibilidad y especificidad en diferentes poblaciones afectadas de periodontitis son heterogéneos. La sensibilidad y especificidad para A. actinomycetemcomitans varía de un 45-96% y un 73-89%, respectivamente, y para P. gingivalis en 94-100% y un 38-85%, respectivamente (171;225-227). El desarrollo de la PCR cuantitativa, con la aparición de la PCR a tiempo real ha demostrado un alto grado de sensibilidad, especificidad y es un método muy reproducible (228). La sensibilidad y especificidad con este método es para A. actinomycetemcomitans de 75 y 93% respectivamente, para P. gingivalis de un 71% y un 85% respectivamente, y para T. forsythensis de un 100% y un 12% respectivamente (114).