Materials &
4.2. METHODS EMPLOYED
Hasta este punto se ha analizado cómo se vinculan las FABP intestinales con membranas de distinta composición y en distintas condiciones de incubación. Ya que tanto la IFABP como la LFABP se expresan en cantidades abundantes en el epitelio intestinal, quisimos analizar el posible intercambio de ligandos entre ellas. Para ello se ideó un ensayo de transferencia de los AOFA entre ambas
proteínas, basado en las diferencias en la intensidad de fluorescencia (rendimiento cuántico, Qf) que muestran al estar unidos a cada una de estas
proteínas.
La Figura 4.7 muestra esquemáticamente el diseño del ensayo, en el que el complejo preformado de IFABP-AOFA se mezcla con la LFABP al tiempo que se registra la fluorescencia del ligando en función del tiempo. Los resultados son bien ajustados a una exponencial simple de la cual se calcula la velocidad de transferencia del proceso. Así, al estudiar el equilibrio de unión de 12AO entre ambas proteínas, se pudo comprobar la partición del ligando entre ambas las FABP y medir luego la velocidad de transferencia de 12AO desde la IFABP hacia la LFABP. Los ensayos se repitieron con 16AP (antroiloxi-derivado del palmitato) para analizar la influencia de la estructura del ligando.
Figura 4.4. - Ensayo de Transferencia de ligando entre FABP intestinales. La figura muestra el esquema del ensayo de transferencias de 12AO desde IFABP a LFABP. El mismo se realiza en un módulo cinético de flujo detenido que permite seguir el aumento de la intensidad de fluorescencia del 12AO a medida que este se trasfiere al sitio de
La Figura 4.8 muestra los resultados al cambiar la concentración de la LFABP para ambos ligandos analizados. Se observa un aumento proporcional de la velocidad de transferencia del ligando con la concentración de la proteína aceptora, y el afecto es más notorio con 12AO que con 16AP (Figura 4.8, inserto). La interpretación es análoga al ensayo de transferencia hacia vesículas fosfolipídicas; por lo que podemos concluir que la transferencia de ligandos entre las FABP intestinales es de naturaleza colisional, brindando la primera evidencia experimental de esta característica de las FABP de la literatura. La diferencia en la velocidad de transferencia al emplear 12AO o 16AP podría explicarse teniendo en cuenta que IFABP y LFABP poseen afinidades similares por FA saturados, pero esta última presenta mayor afinidad por los FA insaturados que la primera.
Figura 4.8. - Transferencia de AOFA entre FABP intestinales. Un aumento de la concentración de LFABP aceptora induce un aumento proporcional sobre la velocidad de transferencia de 12AO y 16AP desde IFABP. El inserto de la figura muestra la velocidad transferencia de AOFA en forma relativa al primer valor (15μM LFABP).
4.3. - Conclusiones
La interacción física entre FABP con membranas fosfolipídicas se analizó directamente, por el marcaje radioactivo de las proteínas por entrecruzamiento activado por la luz con un derivado fosfolipídico radioiodinado; e indirectamente, por la desestabilización y el goteo de un complejo fluorescente del interior de vesículas. La inserción de distintas proteínas en membranas ha sido caracterizada empleando el reactivo fotoactivable mencionado y otros ampliamente descriptos en la bibliografía (Weber, J. Am. Chem. Soc. 1995; Córsico, J. Biol. Chem. 2001; Weber, J. Biol. Chem. 1994; Durrer, J. Biol. Chem. 1995; Durrer, ,J. Biol. Chem. 1996; Vergeres, J. Biol. Chem. 1995, Garner,. Biol. Chem. 1998). Nuestros resultados muestran que las FABP intestinales nativas interaccionan con membranas, y que dicha interacción es modulada tanto por la presencia del ligando como por la composición de las membranas en forma diferencial para IFABP que para LFABP. Sin embargo, los ensayos indirectos muestran que la organización de las membranas fosfolipídicas se ve levemente alteradas por la interacción con las FABP y no se registran diferencias entre las distintas FABP; salvo en el caso de la HL-IFABP, carente de la región α- helicoidal, que sería fundamental para que la interacción con las membranas tenga lugar.
Es interesante mencionar que los distintos compartimentos membranosos intracelulares presentan una composición fosfolipídica característica, y que la cardiolipina es un constituyente relevante de las membranas internas y externas mitocondriales (Hovius, Biochim. Biophys. Acta 1990), y su participación en la interacción membrana-proteína ha sido bien apreciada (Schlattner, J. Biol. Chem. 2004). Por otro lado, fosfatidilserina muestra también una distribución desigual en las distintas fracciones membranosas. En particular la composición de la hemicapa citosólica de la membrana plasmática es característicamente rica en fosfatidilserina.
La función más ampliamente aceptada de las FABP es la de transportadores intracelulares de FA y demás lípidos. Las diferencias en la interacción con membranas y la transferencia de ligandos con la composición de
las vesículas y la estructura del ligando, respectivamente, podrían ser las bases moleculares responsables de las funciones específicas de IFABP y LFABP. Así, la interacción diferencial de las FABP con membranas artificiales de distinta composición podría ser un indicio de su función en el trasporte de lípidos durante la carga o descarga del ligando desde o hacia membranas de distinta composición.
La interacción de IFABP con las membranas pareciera ser más importante en su forma holo que en su forma apo, y lo opuesto se observa para la LFABP. En trabajos previos se demostró que ambas proteínas son capaces de extraer FA de membranas donoras (Thumser, J. Lipid Res. 2000). En este sentido, ensayos reversos de transferencia de AOFA, desde vesículas donoras hacia FABP aceptoras, mostraron diferencias significativas al comparar la transferencia de FA hacia IFABP y LFABP que, a pesar de que la velocidad de transferencia de FA reverso es independiente de la concentración de proteína aceptora, el mecanismo de transferencia sí es sensible a la composición de lípidos para el caso de la IFABP, o a la concentración de sales (fuerza iónica) en el caso de LFABP (Thumser, J. Lipid Res. 2000). Esto nos indica que la disociación de los FA de las bicapas fosfolipídicas modelo es independiente de la interacción con LFABP; mientras que un complejo intermediario con la membrana donora participa de la extracción de FA por parte de la IFABP. Se propuso que estas diferencias se debían a que los complejos FABP-membrana serían distintos en cada caso; y los resultados aquí presentados apoyan esta posibilidad, junto con los cambios estructurales ya descriptos en las estructuras de NMR y cristalográfica debido a la presencia del ligando (Hodsdon, Biochemistry 1997; Wang, Biochemistry. 2002; He, Biochemistry 2007).
Por otro lado, si tenemos en cuenta los resultados parciales obtenidos hasta el momento de los ensayos de goteo de Tb/DPA, vemos que las membranas no sufren una distorsión tan significativa en su integridad estructural al incubarlas con las FABP intestinales nativas respecto al cambio inducido por Apo AI (Tricerri, Biochim Biophys Acta 1998). Pero estas diferencias son fácilmente entendibles si se considera que, a diferencia de las FABP, la Apo AI se integra a las membranas gracias un complejo proceso de reorganización
estructural que generaría notorias imperfecciones en la bicapa fosfolipídica por dónde el complejo fluorescente podría filtrarse. Esto nos indica que las proteínas serían capaces de asociarse a membranas y extraer o ceder FA sin necesidad de grandes reorganizaciones de la membrana, fundamental para mantener intacto gradientes y potenciales transmembrana a través de las membranas donoras. Además, para cada proteína, no se observaron diferencias significativas tampoco al cambiar la composición de las membranas por el reemplazo de con un 25 mol% de cardiolipina. Esto puede interpretarse como que las proteínas no interactúan de forma distinta con ambos tipos de bicapas fosfolipídicas y las diferencias en las velocidades de transferencia de ligandos deben buscarse en el contacto superficial pero específico, posiblemente con las cabezas polares de los fosfolípidos, más que debido a una inserción diferente en la región hidrofóbica de las bicapas. Llamativamente, la presencia de la HL-IFABP no parece tener un efecto importante sobre la integridad de las bicapas, lo que remarca la importancia de la región α-helicoidal. Además la región α-helicoidal de LFABP también podría estar participando de la interacción según marcan los resultados con la quimera αLβIFABP.
Usando un ensayos de competencia con Citocromo c (Córsico, Proc. Natl. Acad. Sci. 1998) y de espectroscopia IR (FTIR) (Wu, Biochemistry 2001), se propuso originalmente la importancia de la región α-helicoidal en la interacción de IFABP con membranas. Los resultados aquí presentados, no sólo confirman estas observaciones mediante dos nuevas metodologías, sino que también los hacen extensivos para LFABP, y reafirman la importancia de la región α- helicoidal de las FABP en el rol específico de cada isoforma, en total concordancia con los resultados de los ensayos cinéticos de transferencia de FA desde las FABP intestinales hacia membranas.
En cuanto a la interacción entre IFABP y LFABP capaz de transferir FA entre ellos, es importante remarcar que el rango de velocidades observadas para 12AO es equivalente al que presenta la transferencia del mismo ligando desde IFABP hacia EPC-SUV (150-600 μM); lo que lo vuelve de gran relevancia biológica al momento de proponer un modelo funcional para estas proteínas, ya
que ambos provesos estarían coexistiendo. De este modo, de tener funciones específicas las FABP intestinales, la partición del pool soluble de FA libres entre ambas proteínas condicionaría el destino metabólico de los mismos en función de las posibles vías de descarga activadas para cada una de las FABP. En particular, los factores que modulan la expresión de las FABP (FA ramificados, retinol, ácido retinóico, y distintas drogas hipolipemiantes que actúan vía los PPAR) (Schachtrup, Biochem J. 2004) podrían, de este modo, modificar el destino metabólico de los FA.