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Los IELs no aparecen en ratón hasta la tercera semana de vida, cuando comienzan a ubicarse en el epitelio hasta alcanzar el máximo número a la sexta o séptima semana (104). El número de IELs TCR αβ depende de la presencia de antígenos en la dieta, según demuestran estudios comparativos hechos en ratones crecidos en condiciones libres de patógenos (Germ Free-GF) (185,186). Por el contrario, la flora intestinal no afecta el número de IELs TCRγδ.

3.5.1 Origen de los IELs.

En ratón existen los mismos subtipos de IELs que en humanos. Las variaciones se encuentran en la proporción relativa de estas subpoblaciones (tabla 1). El ejemplo más claro lo constituye la mayor proporción de linfocitos Tγδ respecto a losαβ. Estos superan el 50% de los IELs, de los cuales la mayoría expresan el correceptor CD8αα(127). IELs TCRαβ CD8αα+. Entre los subtipos de Linfocitos TCRαβ, los CD8αα+ (CD4+ o CD4-), son los únicos que se encuentran exclusivamente en el epitelio. La mayoría de estos linfocitos son de origen tímico. Ratones knockout paraβ2m-/- _{carecen de esta población, aunque si se seleccionan en ratones carentes de MHC-} clase I (figura 3.6). Ratones deficientes de TAP, tienen muy pocos IELs con el fenotipo CD8αα+_. Como CD1, Qa1 y TL son independientes de TAP (es decir están presentes en TAP-/-), la selec- ción estaría asociada a MHC clase Ib, dependiente de TAP. Efectivamente, la selección de estos linfocitos está asociada a Qa-2 (un MHC clase1b), como lo demuestran dos hechos: el alto núme- ro de IELs CD8αα+ en ratones transgénicos que hiperexpresan Qa2 y la ausencia en knockout Qa2-/-. Se desconoce que elemento independiente de TAP se encarga de la selección de los pocos IELs CD8αα+ que aparecen en los ratones TAP-/-_{. Podría ser el mismo Qa2, que en rato-} nes TAP-/-, al carecer de péptidos asociados, sería menos eficiente (127). Unos pocos IELs TCRαβ CD8αα+ se seleccionarían extratímicamente. Ratones timectomizados RAG-2 -/- reconstituyen esta población (y ademásγδCD8αα+) cuando se les inyecta con células de Médula ósea de donantes atímicos (187). IELsγδ CD8αα+. También son característicos del epitelio los IELs TCRγδCD8αα+. Esta población, a diferencia de la anterior, es normal en ratonesβ2m-/-_y

también están presentes en knockout para MHC-clase I y clase II. No se seleccionarían en el timo. Cuáles son las evidencias? Ratones atímicos tienen linfocitos Tγδ que se distribuyen en el intestino, principalmente en el epitelio. La transferencia de linfocitos de médula ósea de ratones nude transgénicos para el gen RAG-GFP, permitió determinar sitios de diferenciación extratímica (51). La transferencia de estas células en ratones nude o timectomizados al nacimiento indican que los NLM son los sitios principales de diferenciación.

Ratones nude tienen entre 2-5 veces menos IELsγδ CD8αα+ que los eutímicos (137). IELs CD4+CD8αα+. Este tercer subtipo, se seleccionaría por MHC clase II y la expresión de CD8αα+ ocurriría en la mucosa.

Hayday hace una clasificación en IELs Tipo a y Tipo b (103). Los IELs Tipo a serían en su mayoría CD8αβ+ TCRαβ, semejantes a los que presentan una circulación sistémica: ausentes en ratones carentes de MHC clase I, se seleccionan en el timo y serían activados en las Placas de Peyer, o en las zonas extrafoliculares del intestino, desde donde irían a los linfáticos mesentéricos para pasar de los linfáticos eferentes hacia al conducto torácico y de ahí a la sangre. Luego volverían a la LP del intestino.

Los IELs TCRαβCD8αα+ y TCRγδCD8αα+ anteriormente mencionados entran dentro de los de Tipo b. Se generan en un número más reducido en ratones atímicos.

En resumen, la linfopoiesis extratímica es un mecanismo minoritario en la diferenciación T que ocurre principalmente en los NLM y en condiciones de timopoyesis defectiva (51).

3.5.2 Diferencias funcionales entre Tipo a y Tipo b.

El desarrollo de los linfocitos Tipo b en ratones carentes de moléculas polimórficas de MHC, sugiere un reconocimiento más restringido de estas poblaciones. Las evidencias son (103): 1) No han sido detectados via linfáticos ni en el conducto torácico (53), 2) su desarrollo no sería depen- diente de antígenos bacterianos o de la dieta, 3) no hay evidencia de memoria inmunológica, 4) es lógico que sean estimulados por las mismas células epiteliales, 5) reconocerían estructuras menos polimórficas, probablemente propias e inducidas en caso de infección o transformación, 6) ratones transgénicos para un TCR son seleccionados positivamente (y no negativamente) por la expresión constitutiva de su antígeno en periferia (188).

32_{MICA y MICB son moléculas polimórficas codificadas dentro del MHC con poca homología con las molé-}

culas de HLA-clase I. No presentan péptidos, ni se asocia aβ2m. Su expresión está restringida a células epiteliales intestinales y su región promotora tiene elementos de respuesta a estrés térmico, similares a los encontrados en los genes de hsp70. El ligando de MIC es NKG2D. ULBP (UL16-binding protein) también es una molécula estructuralmente semejante a MICA/B. Tienen la particularidad de que se une a la proteína UL16 de citomegalovirus, lo que interfiere en el reconocimiento de ULBP por NKG2D (183). RAE1 (Retinoic Acid Early inducible 1) es una molécula de MHC clase Ib con homología a MIC, que se expresa en ratón. Al igual que MIC y ULBP, tampoco requiere deβ2m para su expresión. T10/T22 son moléculas de clase IB expresadas en ratón y que son reconocidas por algunas poblaciones de células Tγδ(184).

Introducción

53

MHC clase I

Dependiente de TAP y β2m

TAP -/- reducido número de IELs TCRαβ CD8 MHC -/- no afecta IELs TCRαβ CD8αα

no afecta IELs TCRγδ

Independiente de TAP CD1, Qa-1, TL

TAP -/- no afecta IELs TCRαβ CD8αα

CD1 -/- no afecta IELs MHC clase Ib

MICA/B, TL, Qa-2, CD1, Rae-1

Independienteβ2m MICA/B- Rae-1 Dependienteβ2m β2m -/- ausencia de IELs TCRαβ CD8αα no afecta IELs TCRγδ Dependiente de TAP

Qa2 -/- reducido número de IELs TCRαβ CD8 αα no afecta IELs TCRγδ

MHC clase I

Figura 3.6: Moléculas clásicas de MHC-clase I y no clasicas MHC clase Ib. El esquema indica el

requerimiento deβ2m y TAP para la expresión en membrana de dichas moléculas. La carencia de algunas de dichas moléculas pueden interferir en la selección o supervivencia de distintas pobla- ciones de IELs. Basado en (127).

Los antígenos TL (thymus leukemia) son moléculas no clásicas de MHC clase I dependientes de β2m que se expresan abundantemente en el epitelio de la mucosa intestinal de ratones. No presentan péptidos y su unión con el homodímero CD8ααes independiente de la especificidad del TCR (189). La interacción de los IELs CD8ααcon su ligando TL, induce una baja proliferación y respuesta citotóxica, mientras que incrementa la síntesis de citoquinas, lo que sugiere que la modulación a través del homodímero CD8αα, protegería del daño de las células epiteliales (190). Esta población tendría funciones reguladoras, ya que se ha visto que IELs TCRαβCD8ααson capaces de controlar el desarrollo de la colitis inducida por transferencia de células CD4+CD45RBhi , a través de un mecanismo dependiente de IL-10 (191).

En el intestino, algunos IELs, principalmenteγδ, a partir de la secreción de KGF-β estarían ayudando a la proliferación de las células epiteliales (1929. Esto se ha observado en un modelo de inducción de colitis por Dextran sulfato de Sodio (DSS), en donde ratones carentes de células

γδson incapaces de reparar la mucosa cuando se suspende la administración de DSS. También se ha visto que células T γδ presentes en la piel de ciertos ratones, reconocen keratinocitos estresados o dañados, e intervienen en la reparación del tejido a través de la producción de factores de crecimiento como KGF-β(193).

Si bien no se ha descrito que IELs γδde la mucosa intestinal participen en la regulación del infiltrado producido en casos de inflamación, si se ha determinado que en un modelo de dermati- tis, linfocitos Tγδ controlan la inflamación cutánea inhibiendo la migración de las células Tαβ (194).

3.5.3 Oligoclonalidad de los IELs en ratón. Seis datos concluyentes.

El análisis de las cadenasβdel TCR en IELs CD8αβ+_{ha demostrado que también en ratón el} repertorio es oligoclonal, en contraste con los linfocitos T de periferia. Segundo, estos estudios también confirman que existen clonotipos compartidos entre IELs y LLP CD8+ en un mismo ratón (53). Tercero, los blastos del conducto torácico comparten idénticos clonotipos TCR β con los IELs CD8αβ. Cuarto, los mismos clonotipos se hayan distribuidos a lo largo de diferentes niveles del intestino delgado. Quinto, los repertorios son diferentes entre ratones de una misma cepa. Sexto, los IELs CD8ααtambién son oligoclonales, pero tienen clonotipos diferentes a los IELs CD8αβ, lo que avala el hecho de que sean poblaciones de distinta ontogenia (137).