2. Background Report
2.3. Case Study: Tokyo
2.3.3. Problems facing Tokyo
Las biopsias se lavaron dos veces en medio de cultivo y disgregaron mecánicamente con una pipeta Pasteur. El material resultante se transfirió a placa de 24 pocillos y cultivó en IMDM (Gibco, Invitrogen Corporation, Paislay, Scotland) y 10 % de Suero A+ (SA) Humano sin IL-2 exógena, ni cualquier otro factor de crecimiento. Al cabo de 72 hs de cultivo los linfocitos se recogieron del fondo de la placa y se clonaron en placas fondo en U de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Denmark). 2.1 Protocolo Básico: Clonado de Linfocitos T
El clonado de células T se realizó por dilución límite. Las células recogidas se contaron en cámara de Neubauer. 1,2 x104células se resupendieron en 6000 ul de medio de cultivo (IMDM, 10% SA, Penicilina/Streptomicina). A partir de esta concentración celular (100 células/50 ul/poci- llo), se realizaron diluciones seriadas para obtener placas con 10, 5, 2.5, 1.25, 0.6 y 0.3 células/ pocillo. Las células se estimularon con 0.5 µg/ml de PHA-L (L2769, Sigma Chemical, ST Louis, MO, USA) y 5 x105 PBMC autólogos irradiados (60 Gy, CLINACR 2100C, Palo Alto, CA) como células alimentadoras ( “feeder cells” )1,2. Al cabo de 3 días, se añadió r IL-2 (provista por M. Gately, Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ).
Las células T se reestimularon cada 10 -14 días en las mismas condiciones, con la diferencia de que al cabo de la tercera estimulación se agregó una mezcla 1:10 de una línea B autóloga (preferentemente) transformada con el Virus Epstein Bar (B-LCL) y PBMC alogénicos también como células alimentadoras. En el cultivo la relación entre las células T, los PBMC y las líneas B linfoblastoides es 1:10:1 respectivamente. En placas de 96 por cada 5000 linfocitos T se agrega- ron 50000 PBMC y 5000 B-LCL preferentemente autólogos. Cuando la estimulación se realizó en placa de 24 (Nunc), la relación de alimentadoras se mantuvo, incrementándose el número de células: En un volumen final de 2 ml, entre 100.000 y 500.000 linfocitos T se estimularon con 1x106PBMC y 1x105B-LCL. Por último, cuando el número de linfocitos T a estimular alcanzó el millón de células, se agregaron 1x107PBMC y 1x106 B-LCL. El cultivo se hizo en frascos de 25 cm2(Nuncclon) en un volumen final de 10 ml.
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El medio condicionado de células T estimuladas con mitógenos permitio el cultivo y clonado de células T. Este medio descubierto en 1976 tenía lo que se denominó T cell Growth Factor (Science 1976. 193: 1007. Selective in vitro growth of T lyphocytes from normal human bone marrows). Este factor fue definido en el First lymphokine workshop de 1979 como IL-2.
2.1.1 Protocolo asociado: Procesamiento de suero
El suero humano utilizado para el ciltivo de clones se obtuvo a partir de extracciones realizadas a donantes voluntarios de sangre. Estos donantes eran hombres, grupo A+o AB+que no hayan recibido tranfuciones y exentos de HIV+, hepatitis B(HBV), Hepatitis C (HCV) , Ac´s (Treponema Pallidum) y AC´s irregulares anti-eritrocitos (no ABO ni Rh). El complemento se inactivó durante 30 min a 56 ºC. Posteriormente se eliminaron los lípidos por ultracentrifugación (Centrikon T-1160, Kontron Instruments, Finlandia) a 30.000 RPM (100.000 g) durante 1 hr a 4 ºC. Cada suero se alicuotó y congeló a –20 ºC. Nota: RCF (g) = 1.12 x r (mm) x (RPM/1000)2.
2.1.2 Protocolo asociado: Test de sueros
El suero humano fue probado mediante ensayos de proliferación de PBL estimulados con PHA. Las estimulaciones se hicieron con diluciones crecientes de PHA (0, 2, 4 y 8 ug/ml) en placas de 96 fondo plano (NUNC). Al cabo de 72h el cultivo se pulsó con Timidina-H3+ (metil- H3+Timidina en solución acuosa. AE: 74GBq/mmol- 2ci/mmol (Ref: TRA310) 5ml (185 MBq 5 mCi))durante 18 hs. Para la validación del suero se tuvieron en cuenta los índices de proliferación y el nivel basal de incorporación del isótopo. Niveles bajos de proliferación en presencia de mitógeno, así como un nivel basal alto, fueron los criterios tomados para descartar el suero analizado.
2.1.3 Protocolo asociado: Titulación de IL-2 utilizando la línea CTLL-2
La concentración óptima de IL-2 se obtuvo a partir de la titulación realizada sobre una línea de ratón (CTLL-2) que depende de esta citocina para su crecimiento. El protocolo utilizado fue el siguiente: (1) Centrifugar las células CTLL-2 en 7 ml y resuspender en 2 ml de medio RPMI 20% SFB / 0.00005 M B2 ME. (2) Contar y llevar a 1 x 105 cel/ml para hacer el test. (3) Hacer diluciones seriadas desde 400 hasta 0 U/ml. en la misma placa de 96 (fondo plano). Sembrar el primer well con 100 ul de la dilucion de IL-2. Tomar 50 ul y comenzar las diluciones; (4) Sembrar 50 ul de la dilucion de células en cada pocillo. Saber que la concentracion final en el primer pocillo será de 100 ul/ml luego de agregar los 50 ul de células. Se puede empezar por una concentracion mas alta de IL-2; (5) Poner Timidina a las 24 h (es el tiempo que tarda en morir el pocillo control sin IL-2 que generalmente es de 24h; 6) Cosechar transcurridas 12 h; (7) Hacer grafica c.p.m vs concentración de IL-2. La cantidad de IL-2 seleccionada es la mínima a la que se alcanza el máximo de proliferación.
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La Leucoagglutinin (PHA-L) es una lectina obtenida de Phaseolus vulgaris (red kidney bean). Esta aglutinina (Phaseolus vulgaris agglutinin) consiste de dos especies moleculares: la PHA-E (Eritroaglutinina) con baja capacidad mitogénica y alta actividad eritroaglutinante y la PHA-L, altamente mitogénica y leucoaglutinante, pero poco aglutinadora de glóbulos rojos. Mitogénica a <5 ug/ml. Ref : Rigas, DA and Osgood, EE, J. Biol. Chem., 212, 607 (1955).
2.1.4 Protocolo asociado: Aislamiento de PBMC por gradiente de Ficoll-Isopaque
La separación de células mononucleares de sangre periférica se realizó utilizando gradientes de densidad en Ficoll-Isopaque (LymphoprepTM1077, Axis-Shield PocAS, Oslo, Norway)(Boyum, A (1968), Scand J. Clin. Invest., 21 (Suppl.97), 77-89)3. El método permite la separación de célu- las mononucleares que tienen una densidad inferior a la de los polimorfonucleares (granulocitos) y eritrocitos. La separación en un medio isosmótico de densidad igual a 1, 077 g/ml, permite que los eritrocitos y PMN sedimenten a través del medio y se forme una banda claramente visible con las células mononucleares entre la muestra y la interface medio/muestra. La sangre se diluye 1:1 en PBS (Phosfated buffer saline, Ph: 7, 2-7,4) y se aplica sobre el medio de centrifugación (Ficoll- Isopaque) procurando no romper la interfase. La muestra se centrifuga a 600g , 30 min a 20º C. La banda se recupera del gradiente y se lava 3 veces para eliminar restos de medio y plaquetas. El LymphoprepTMcontiene: Diatrizoato de sodio (9.1 % p/v), Polisacárido (5.7 % p/v). Su densi- dad es de 1,077 g/ml.
2.1.5 Protocolo asociado: Irradiación de células
La irradiación de las células se realizó en un acelerador lineal CLINACR2100C (VarianTM, Palo Alto, CAen el Servicio de Radioterapia del Hospital Germans Trias i Pujol.). Esta máquina está dedicada al tratamiento radioterápico del cancer. La irradiación se llevó a cabo en un contenedor de metacrilato lleno de agua. En su interior existe una gradilla donde se sitúan los criotubos con las células a irradiar.
Las condiciones de irradiación fueron las siguientes:
Tipo de irradiación: Fotones de frenado (Bremsstrablung photons). Energía de los fotones: 6 MV. Distancia fuente radiación a la superficie del contenedor: 56 cm. Tamaño del campo de irradia- ción: 25 x 25 cm a 100 cm de la fuente. Dosis administrada: 60 Gy. Tasa de irradiación en la mitad del contenedor: 15, 2 Gy/min. Homogeneidad del campo: mejor del 5%.
2.1.6 Protocolo asociado: Congelación de células
Las células T fueron congeladas en una solución de SFB con 10% de DMSO (DimetilSulfóxido). Para un Nº comprendido entre 50.000-500.000 cel se agregó 300 ul de la solución de congela- ción, entre 500.000 y 2x106 se congelaron en 500 ul de solución y para una cantidad superior a 4x106se añadió 1 ml de solución. Las células se mantuvieron un mínimo de 20 min en gradillas de polispan en contato con vapores de Nitrógeno. Posteriormente se las guardó en cajas de polispan en refrigerador a –70ºC. Finalmente, en un plazo comprendido entre 1 y 7 días se almacenaron en tanques de Nitrógeno líquido (-196ºC).
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Ficoll-Isopaque. El método original descrito por Arne Boyum en 1968 utilizaba un compuesto de ácido metrizoico (PM 628) y Ficoll. El Lymphoprep reemplaza el metrizoato por el ácido diatrizoico. (PM: 614). Estos son compuestos derivados del ácido triiodobenzoico, capaces de formar soluciones de alta densi- dad. Estos compuestos deben ser protegidos de la luz ya que su exposición a la luz visible y sobre todo a la UV (244nm), produce la liberación de los iodos del grupo bencénico. Estas moléculas iodadas (Isopaque) eran utilizados en líquido de contraste para las radiografías en rayos –X.