Para definir los tumores de cáncer de mama triple negativo (TNBC) en “tipo Basal”, se realizó la detección mediante inmunohistoquímica de los marcadores basales: CK5, CK14 y de EGFR. Un tumor TNBC fue definido “tipo Basal” si expresó la CK5 y/o la CK14 y/o EGFR. En cambio, los tumores sin expresión de estas proteínas (CK5-/CK14-/EGFR-) fueron definidos como “tipo no-Basal” que derivan del panel definido por Nielsen y cols., (2004).
El análisis de cada marcador “tipo Basal” en los 48 tumores TNBC, por inmunohistoquímica, reveló que un 65% (31/48) de los casos expresa la CK5, un 51% (24/47) expresó la CK14, y un 43% (20/46) fueron positivos para EGFR (tabla 3). La diferencia en el total de los tumores analizados para cada marcador fue producto de la ausencia de células tumorales en los casos T_TN06_2 y T_TN28, que resultaron no informativos para el o los marcadores respectivos (tabla 3, figura 5).
Así, con este panel de marcadores proteicos, se encontró que un 77% (37/48) de los tumores TNBC se definieron en el subgrupo “tipo Basal” por expresar uno o varios de los marcadores basales. En cambio, un 23%(11/48) de los casos fueron clasificados como “tipo no-Basal”, ya que resultaron negativos para la expresión de los marcadores CK5-/CK14-/EGFR- (tabla 3, figura 5).
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Tabla 3: Expresión de los marcadores “tipo Basal”, citoqueratinas 5, 14 y de EGFR, en los tumores de cáncer de mama triple negativo. Expresión Puntaje-H Expresión Puntaje-H Expresión Puntaje-H Localización celular
T_TN03 Carcinoma ductal invasor no especial II 33 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN21_2 Carcinoma ductal invasor Metaplasico III 50 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN05 Carcinoma ductal in situ NA NA 41 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN06_1 Carcinoma ductal invasor no especial III 42 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN09 Carcinoma lobulillar invasor NA NA 45 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN19 Carcinoma ductal invasor no especial II 62 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN14 Carcinoma ductal invasor no especial III 65 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN42 Carcinoma ductal in situ NA NA 55 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN46 Carcinoma ductal invasor no especial II 65 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_TN15 Carcinoma ductal invasor Tubular I 60 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T5 Carcinoma ductal invasor no especial III 28 - 0 - 0 - 0 NA tipo no-Basal
T_M156 Carcinoma ductal invasor no especial III 48 3+ 3 - 0 - 0 NA tipo Basal
T42 Carcinoma ductal invasor no especial III 31 3+ 15 2+ 10 - 0 NA tipo Basal
T_TN48 Carcinoma ductal invasor no especial III 61 - 0 3+ 3 - 0 NA tipo Basal
T_TN49 Carcinoma ductal invasor no especial III 72 - 0 3+ 3 - 0 NA tipo Basal
T_TN04 Carcinoma ductal invasor no especial III 55 - 0 3+ 15 - 0 NA tipo Basal
T11 Carcinoma ductal invasor no especial III 62 3+ 3 - 0 - 0 NA tipo Basal
T_TN50 Carcinoma ductal invasor no especial III 67 3+ 3 - 0 - 0 NA tipo Basal
T_TN38 Carcinoma ductal invasor no especial III 45 - 0 - 0 3+ 90 membrana tipo Basal
T_TN39 Carcinoma ductal invasor no especial III 62 - 0 - 0 1+ 70 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN47 Carcinoma ductal invasor no especial III 66 3+ 100 - 0 3+ 270 membrana tipo Basal
T_TN43 Carcinoma ductal invasor no especial III 77 1+ 70 3+ 15 - 0 citoplasma tipo Basal
T_TN08 Carcinoma ductal invasor Papilar NA 49 2+ 180 1+ 5 3+ 140 citoplasma tipo Basal
T_TN24 Carcinoma ductal invasor no especial III 38 3+ 90 2+ 10 - 0 NA tipo Basal
T_TN10 Carcinoma ductal invasor no especial III 61 3+ 120 - 0 2+ 60 citoplasma tipo Basal
T_TN16 Carcinoma ductal invasor Medular ND 30 3+ 120 - 0 3+ 70 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN17 Carcinoma ductal invasor Mucinoso III 30 3+ 150 - 0 3+ 300 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN31 Carcinoma ductal invasor no especial III 45 3+ 100 3+ 240 - 0 NA tipo Basal
T24 Carcinoma ductal invasor no especial II 33 3+ 30 3+ 150 2+ 180 membrana tipo Basal
T_TN11 Carcinoma ductal invasor Medular III 33 3+ 90 3+ 120 - 0 membrana tipo Basal
T43 Carcinoma ductal invasor no especial III 58 3+ 300 3+ 120 - 0 NA tipo Basal
T41 Carcinoma ductal invasor no especial III 33 3+ 150 3+ 45 - 0 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN27 Carcinoma ductal invasor no especial III 42 3+ 210 3+ 90 1+ 40 citoplasma tipo Basal
CK14 EGFR Clasificación del
Subgrupo
ID Tumor Histología Tipo Histológico
del tumor Grado del tumor Edad de diagnóstico CK5
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Continuación
En la tabla se indica NA: No aplica, ND: No definido. Además, el grado de diferenciación de los carcinomas ductal invasor: (I) bien diferenciado, (II) moderadamente diferenciado y (III) pobremente diferenciado. La intensidad de tinción de cada marcador proteico fue estimada usando los valores: (-): negativo, (1+): débil intensidad, (2+): moderada intensidad, y (3+) fuerte intensidad.
Expresión Puntaje-H Expresión Puntaje-H Expresión Puntaje-H Localización celular
T_TN28 Carcinoma ductal in situ NA NA 58 3+ 210 2+ 40 NA NA NA tipo Basal
T39 Carcinoma ductal invasor no especial III 43 3+ 270 3+ 150 1+ 50 citoplasma tipo Basal
T_TN01 Carcinoma ductal invasor Medular ND 26 3+ 300 3+ 45 2+ 180 membrana tipo Basal
T_TN06_2 Carcinoma ductal in situ NA NA 42 3+ 15 NA NA NA NA NA tipo Basal
T_TN34 Carcinoma ductal invasor no especial III 47 - 0 - 0 3+ 30 membrana tipo Basal
T_TN07 Carcinoma ductal invasor Medular ND 30 3+ 120 3+ 15 1+ 60 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN20 Carcinoma ductal invasor no especial II 40 3+ 90 - 0 3+ 270 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN45 Carcinoma ductal invasor no especial III 53 2+ 60 1+ 30 2+ 40 citoplasma/membrana tipo Basal
T_P4 Carcinoma ductal invasor no especial III 22 3+ 120 3+ 3 - 0 NA tipo Basal
T_TN51 Carcinoma ductal invasor no especial III 42 3+ 300 - 0 1+ 40 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN44 Carcinoma ductal invasor no especial III 41 1+ 60 3+ 3 2+ 120 citoplasma tipo Basal
T_TN02 Carcinoma ductal invasor no especial III 29 2+ 60 3+ 150 2+ 50 membrana tipo Basal
T_TN32 Carcinoma ductal invasor no especial III 50 3+ 210 3+ 150 - 0 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN12 Carcinoma ductal invasor Metaplasico II 32 3+ 300 3+ 180 3+ 300 citoplasma/membrana tipo Basal
T_TN21_1 Carcinoma ductal invasor Metaplasico III 50 3+ 300 3+ 285 3+ 240 citoplasma/membrana tipo Basal
CK14 EGFR Clasificación del
Subgrupo
ID Tumor Histología Tipo Histológico
del tumor Grado del tumor Edad de diagnóstico CK5
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A). Estructuras de la glándula mamaria normal.
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Figura 5: Expresión de las citoqueratinas 5, 14, y EGFR en los tumores TNBC. Al costado izquierdo de la figura se indica el tumor TNBC y en la parte superior se indica la proteína correspondiente a la imagen. En la figura B. se indican todos los tumores que fueron definidos como “TNBC/tipo Basal”. C: Tumores TNBC definidos como tipo no-Basal. Los núcleos de las células tumorales se observan de color celeste, el citoplasma está marcado de color rojo. Fotos obtenidas con un objetivo 40X.
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Esto resultados indican que mediante la técnica de inmunohistoquímica, los tumores TNBC frecuentemente presentan un fenotipo “tipo Basal”, sugiriendo que presentan un perfil de expresión génico similar. Por el contrario, los tumores “TNBC/tipo no-Basal” constituyen un grupo diferente, sugiriendo un perfil de expresión génico distinto a los clasificados en “tipo Basal”.
Este resultado es similar a lo descrito en la literatura, en los cuales se indica que no todos los tumores TNBC corresponden al grupo “tipo Basal”, revelando la heterogeneidad de los tumores de cáncer de mama triple negativo. Además, demuestra que es insuficiente usar solo la ausencia de expresión del receptor de estrógeno, del receptor de progesterona y de HER2 con el fin de clasificar los tumores “tipo Basal” como ha sido propuesto en otro trabajo (Cheang y cols., 2008).
Principalmente, los tumores “TNBC/tipo Basal” expresaron conjuntamente más de un marcador proteico en el tejido tumoral. Asi, un 72,9% (27/37) de los casos expresaron tres o dos marcadores basales, sugiriendo que es frecuente la co-expresión de estas proteínas entre los tumores TNBC. Se obtuvieron tres grupos de tumores “TNBC/tipo Basal”. El 30,5% (11/36) de los casos, expresaron los tres marcadores CK5+/CK14+/EGFR+, un 44,4% (16/36) expresaron solo dos marcadores “tipo Basal” (CK5+/CK14+= 62,5% (10/16); CK5+/EGFR+ = 37,5% (6/16)) y finalmente, un 27% (10/37) expresó solo un marcador “tipo Basal”. En este último grupo, la expresión de la CK5+ o CK14+, se observó en aproximadamente en un 5% de las células tumorales del área del tumor. Esto sugiere, que una población focal de células tumorales mantiene la expresión de la citoqueratina correspondiente, mientras que las células restantes pierden la expresión de estas citoqueratina a medida que el tumor se va desdiferenciando. En cambio, los “TNBC/tipo Basal” con solo expresión de EGFR mostraron expresión principalmente en la membrana entre un 10-70% de las células tumorales, con fuerte intensidad en los tumores respectivo (tabla 3). Esto sugiere que los tumores positivos para EGFR se encuentran en un estado
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con aumento de la proliferación celular. Por su parte, aquellos tumores con expresión conjunta de los tres o dos marcadores basales mostraron un mayor número de células positivas con tinción y una distribución heterogénea de cada marcador.
Al analizar la expresión de cada marcador basal en el grupo definido “TNBC/tipo Basal”, el que mayormente los definió fue la expresión de la CK5 en un 83,7% (31/37) de los casos. A diferencia de la expresión de la CK14 que fue de un 65% (24/37) y de EGFR en un 54% (20/37) de los tumores. Esto indica que la expresión de la CK5 es muy importante para definir los casos “tipo Basal” en el conjunto de tumores TNBC.
Respecto a la expresión de las citoqueratinas basales, se ha descrito que la CK5 y la CK14 se aparean para formar los filamentos intermedios de las células basal/mioepitelial de la mama normal, y su patrón de expresión se mantiene durante el proceso de transformación, observándose en las células del tumor (Moll y cols., 1982). De acuerdo a estas evidencias, se esperaba obtener similar proporción de tumores y de sus células tumorales con expresión de ambas citoqueratinas. Sin embargo, los resultados mostraron que un 57% (21/37) de los “TNBC/tipo Basal” fueron positivos para ambas citoqueratinas (CK5+/CK14+) conjuntamente, con una fuerte intensidad de tinción (3+), y clara localización citoplasmática. Incluso, existe una significativa correlación (valor-p de 0,0008) respecto a la expresión de ambas citoqueratinas en los tumores “TNBC/tipo Basal”, sugiriendo co-expresión de CK5 y CK14 en estos tumores. Pero, un 24% (9/37) de los casos CK5-positivos no expresa la CK14, la cual incluso se expresa en un menor porcentaje de células tumorales, sugiriendo que hay una pérdida de expresión de la CK14 en estos tumores. Por lo tanto, muchos de los tumores “TNBC/tipo Basal” presentan formación de los filamentos intermedios utilizando el par de CK5/CK14, las cuales se co-expresan en la misma célula. Sin embargo, en las células malignas principalmente se mantiene la expresión de la CK5 y la CK14 va
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perdiendo su expresión. Estos resultados sugieren que existe una pérdida de expresión de la CK14 o bien una desregulación de la expresión de esta citoqueratina en las células tumorales de los tumores “TNBC/tipo Basal”.
Por otra parte, el análisis de los tumores positivos para EGFR mostró diferentes localizaciones subcelulares de este receptor. Un 30% (6/20) de los casos lo expresó en la membrana de las células tumorales, un 45% (9/20) lo expresó tanto en el citoplasma y membrana, en cambio en un 25% (5/20) se localizó solo en el citoplasma de las células tumorales. La localización de EGFR en la membrana y el citoplasma/membrana, sugiere que en estos casos EGFR se encuentra funcional, produciendo una señalización de proliferación. La sobre-expresión del receptor de EGF, no es específico de las células basal/mioepitelial, pero en este subtipo molecular se ha encontrado expresado en un 60% de los tumores descritos por Perou y cols., (2000) y fue incluido como un marcador para definir tumores “tipo Basal” por Nielsen y cols., (2004). A este respecto, identificamos tumores “TNBC/tipo Basal” con aumento de expresión de EGFR en conjunto con la CK5. Independiente de la localización citoplasmática o de membrana se encontró una asociación significativa de estas dos proteínas en estos tumores (valor-p fue de 0,0127). Esta asociación, sugiere que la CK5 y EGFR fueron co-expresados en las células tumorales de los tumores “TNBC/tipo Basal”. Aún más, no se identificaron tumores con la expresión conjunta de CK14 y de EGFR, solo esto se observó en los tumores con expresión de los tres marcadores (CK5+/CK14+/EGFR+). Sin embargo, en estos casos no podemos demostrar que se encuentren colocalizando en la misma célula tumoral.
Con este panel de tres marcadores “tipo Basal” podemos demostrar que los tumores “TNBC/tipo Basal” presentan patrones de expresión heterogéneos tanto inter-tumor como intra- tumor, siendo predominante la expresión de la CK5. Además, sugiere dos posibilidades de acuerdo
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a la literatura: 1) que existen diferentes poblaciones de células tumorales, indicando que las células iniciales corresponden a CK5+/CK14+, pero estas con el tiempo van perdiendo su expresión, siendo más susceptible la pérdida de expresión de la CK14+. 2) que las células tumorales van desde un estado diferenciado a desdiferenciado. Así, a medida que los tumores se van desdiferenciando van perdiendo sus características iniciales que se ve reflejado por una pérdida del patrón de expresión de las citoqueratinas iniciales.
4.2 Análisis de la expresión y localización de la proteína BRCA1 en la glándula mamaria