Model Structure

Finalmente, tras la realización del análisis genético y utilizando todos los tumores mutantes para EGFR con ADN disponible, se evaluó la sensibilidad de los dos métodos basados en PCR. Para ello, se seleccionaron parejas de tumores con y sin mutaciones en EGFR, que tuvieran un porcentaje de celularidad tumoral similar y cuyo rendimiento en la extracción de ADN, en términos de cantidad y calidad, fuera comparable. En base a la experiencia previa (Angulo et al., 2010), se realizaron diluciones seriadas del ADN extraído de cada tumor mutante en ADN extraído de un tumor sin mutación, hasta que la proporción relativa de ADN mutante con respecto al ADN total a analizar representara el 1%, 3% y 5%, para su análisis con el kit

Therascreen EGFR Mutation Test, y el 10%, 20%, 25% y 30%, para su análisis por secuenciación

directa.

Para valorar la sensibilidad y la especificidad de los anticuerpos empleados en el análisis de mutaciones por IHQ, se compararon los resultados obtenidos con los de los métodos basados en PCR.

A modo de recapitulación, en la siguiente figura (Figura 4) se resume la metodología seguida en el desarrollo del presente trabajo. En ella se diferencian las dos etapas en las que se divide el trabajo: una primera etapa de descubrimiento en la que se ha realizado un estudio de perfiles de expresión génica; y una segunda etapa de traslado a la clínica en la que se ha realizado un estudio de alteraciones genéticas relevantes desde el punto de vista terapéutico para los carcinomas de pulmón, y un estudio comparativo de metodologías para el estudio de mutaciones en el gen EGFR. Asimismo quedan definidas las características de los tumores incluidos en las diferentes series sobre las que se ha realizado cada uno de los estudios, los métodos empleados y los marcadores analizados conforme a los objetivos planteados en cada caso.

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4.1. ANÁLISIS DE PERFILES DE EXPRESIÓN GÉNICA EN CARCINOMAS DE PULMÓN NO MICROCÍTICOS

4.1.1. Análisis no supervisado: estudio de la agrupación de los tumores en función de los perfiles de expresión génica

Para analizar cómo se agrupan las muestras incluidas en el estudio de microarrays en función de sus perfiles de expresión génica se realizó un análisis no supervisado, empleando para ello los 1075 genes que mostraron una mayor expresión diferencial en los seis tejidos de pulmón normal y los 69 tumores de pacientes diagnosticados de NSCLC. En la Figura 5 se representa el dendrograma obtenido tras el análisis no supervisado de los datos de expresión. En él se muestra la agrupación de las muestras en base a las similitudes en los niveles de expresión de los genes analizados. Asimismo, se indican las características clínicas de los pacientes y de los tumores tales como el sexo, el hábito tabáquico, la histología, el tamaño tumoral, el grado de diferenciación, la afectación ganglionar y el estado mutacional para los genes seleccionados (KRAS, EGFR, LKB1 y TP53).

Figura 5. Análisis no supervisado: agrupación de los tumores en función de los perfiles de expresión génica. Dendrograma que resulta del análisis no supervisado de los 69 tejidos tumorales y los seis tejidos normales de pulmón utilizando los perfiles de expresión de los 1075 transcritos más desregulados. Los tejidos normales se destacan en rojo. Las características de los pacientes y las características histopatológicas y genéticas de los tumores también aparecen indicadas. Los colores se corresponden con la siguiente leyenda: GRIS (ausencia de dato); AZUL OSCURO (mujer, no fumador, carcinoma epidermoide, tumor pobremente diferenciado, tamaño tumoral T2-T3, afectación ganglionar (N1-N2) y presencia de mutaciones en el gen indicado); AZUL CLARO (hombre, fumador, adenocarcinoma, tumor bien diferenciado, tamaño tumoral T1, sin afectación ganglionar y ausencia de mutaciones en el gen indicado); AZUL MEDIO (carcinoma de células grandes, tumor moderadamente diferenciado y tamaño tumoral T4).

Con respecto a las alteraciones genéticas y teniendo en cuenta el grupo de tumores en los que se analizaron cada uno de los genes, la frecuencia de mutaciones encontrada en la serie fue la siguiente: 3/30 (10%) para EGFR, 41/69 (59%) para TP53, y 9/30 (30%), para KRAS, no encontrándose, en cambio, ninguna mutación en el gen BRAF. Por su parte, la baja frecuencia de mutaciones en LKB1 (3/30, 10%) en comparación con la descrita en la literatura se explica porque

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la mayoría de los tumores mutantes para LKB1 disponibles para su estudio se incluyeron en un análisis previo realizado con el objetivo de caracterizar la firma genética de los ACs portadores de alteraciones en dicho gen (Fernández et al., 2004).

En el dendrograma se observa una clara separación de los tumores en dos ramas según su tipo histológico, una rama que incluyó a la mayoría de los ACs y otra, al grueso de los SCCs (Figura 5). Así, en la rama de la derecha se agruparon 29 de los 30 ACs incluidos en la serie, además de los tres LCCs y ocho SCCs. Todos los tejidos no tumorales, excepto uno, quedaron incluidos en un mismo grupo dentro de la rama de los ACs. La revisión histológica de dicho tejido reveló un intersticio engrosado por la presencia de infiltrado inflamatorio y con hiperplasia alveolar, alteraciones que podrían justificar suseparación del resto de tejidos normales. Dentro de la relativa heterogeneidad de esta rama del dendrograma, destaca que los tres ACs con mutaciones en el gen EGFR forman un grupo definido dentro de los ACs bien diferenciados. Por otra parte, la rama de la izquierda del dendrograma mostró una elevada homogeneidad en la medida que la mayoría de los SCCs incluidos en el estudio se agruparon en ella (28/36, 78%). No se observó una agrupación clara en ninguna de las ramas de tumores de acuerdo con el género, el hábito tabáquico, el tamaño tumoral, el grado de diferenciación, la afectación ganglionar las alteraciones genéticas distintas de las mutaciones en el gen EGFR.

4.1.2. Análisis supervisado I: estudio de firmas genéticas asociadas con la histología