Modeling Paradigm

2.13 2.13

2.13 Análisis de los datos.Análisis de los datos.Análisis de los datos.Análisis de los datos.

Para el procesamiento de los datos se utilizaron dos programas informáticos: GradhPad Prism4 y Microsoft Office Excel/2003.

Para el análisis estadístico, se utilizó el test de la t-Student, excepto en el caso del análisis de los resultados de la PCR en tiempo real, en cuyo caso se utilizó la prueba de Wilcoxon para muestras apareadas. Las diferencias se consideraron significativas cuando el p-valor fue inferior a 0,05.

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1. 1. 1.

1. IMPLICACIÓN DE LA VÍIMPLICACIÓN DE LA VÍIMPLICACIÓN DE LA VÍA PI3K/AIMPLICACIÓN DE LA VÍA PI3K/AA PI3K/AA PI3K/AKTKTKT EN LA SUPERVIVENCIAKT EN LA SUPERVIVENCIA EN LA SUPERVIVENCIA EN LA SUPERVIVENCIA CELULAR Y EN LA DIFE

CELULAR Y EN LA DIFE CELULAR Y EN LA DIFE

CELULAR Y EN LA DIFERENCIACIÓN NEUROENDORENCIACIÓN NEUROENDORENCIACIÓN NEUROENDORENCIACIÓN NEUROENDOCRINA DE CRINA DE CRINA DE CRINA DE CÉLULAS LNCAP

CÉLULAS LNCAP CÉLULAS LNCAP CÉLULAS LNCAP

La vía PI3K/Akt es necesaria para la supervivencia de la línea celular de cáncer de próstata LNCaP. Nuestro grupo de investigación ha publicado recientemente que la vía PI3K/Akt modula el efecto del EGF sobre la proliferación y diferenciación en dicha línea celular (37)_{. Para profundizar en}

este estudio, analizamos el efecto que tiene la inhibición esta vía, ya sea en ausencia o en presencia de EGF, sobre la supervivencia y la diferenciación NE en células LNCaP. Para ello, tratamos las células con LY294002 (LY29) con o sin EGF y analizamos la muerte celular mediante tres técnicas (ver Materiales y Métodos): la técnica de TUNEL, utilizando la sonda TMRM y la fragmentación de PARP (ppppoly AAAADP-rrrribose ppppolymerase). Como se observa en la Figura 17, el tratamiento de las células con LY29 provocó un aumento significativo tanto de células TUNEL positivas, como de TMRM negativas e indujo la fragmentación de PARP, todos ellos indicadores de muerte celular. Sin embargo, la presencia del EGF atenuó significativamente la muerte celular observada, indicando que el EGF induce supervivencia celular activando otras vías de señalización que reemplazan a la vía de PI3K/Akt.

Figura Figura Figura

Figura 17171717:::: EEEEfecto sobre la supervivencia celular del tratamiento confecto sobre la supervivencia celular del tratamiento confecto sobre la supervivencia celular del tratamiento confecto sobre la supervivencia celular del tratamiento con EGF, EGF, EGF, EGF, al inhibiral inhibiral inhibir al inhibir PI3K/Akt

PI3K/Akt PI3K/Akt

PI3K/Akt. . . . Se cultivaron células LNCaP (300.000 células por placa) en RPMI con 7% de SFB. A las 48hs se reemplazó el medio completo por medio sin suero (0%) durante 24hs. Se trataron con o sin EGF (10-8_{M) en presencia o ausencia de LY29 (20µM). A las 24hs, se analizó la supervivencia celular:}

A) A) A)

A) por la técnica de TUNEL; B)B)B)B) utilizando la sonda TMRM. Se muestra la media ± ESM de cuatro experimentos independientes (** p<0,01). C)C)C)C) analizando la fragmentación de PARP por western blot y como control de carga β-tubulina. Se muestra un experimento representativo de cuatro experimentos independientes.

Igualmente nuestro grupo de investigación demostró que el EGF impedía la diferenciación neuroendocrina, provocada por la privación androgénica

(37)_{. Sin embargo, este efecto desaparece al añadir LY29. Como}

observamos en la Figura 18A, el tratamiento con EGF más LY29 provocó un aumento de los niveles de enolasa específica neuronal (NSE) de aproximadamente el 100%, así como un aumento significativo (test de

Wilcoxon ** p<0,01) del ARN mensajero de cromogranina B (CrgB) (Figura 18B).

Figura Figura Figura

Figura 18181818: Efecto sobre la diferenciación NE del tratamiento con EGF, al inhibir : Efecto sobre la diferenciación NE del tratamiento con EGF, al inhibir : Efecto sobre la diferenciación NE del tratamiento con EGF, al inhibir : Efecto sobre la diferenciación NE del tratamiento con EGF, al inhibir PI3K/Akt.

PI3K/Akt. PI3K/Akt.

PI3K/Akt.Se cultivaron células LNCaP (300.000 células por placa) en RPMI con 7% de SFB. A las

48hs se reemplazó el medio completo por medio sin suero (0%) durante 24hs. Se trataron con o sin EGF (10-8_{M) en presencia o ausencia de LY29 (20µM). Transcurridas 24hs, A) A) A) A) los extractos celulares}

se analizaron por western blot con anticuerpos contra: NSE, P-Akt (Ser473) y β-tubulina. (* p<0,1 versus EGF). B)B)B)B) Se aisló el ARN para su posterior análisis por PCR en tiempo real. El gráfico se corresponde al cociente de CrgB con respecto a su control 18S (Ct ± DS) obtenido de 3 experimentos independientes. C)C)C) Se fijaron las células, se permeabilizaron y se incubaron con el anticuerpo contra C) CrgA y un secundario marcado. Los núcleos fueron teñidos con DAPI. En A y C se muestra un experimento representativo de tres independientes.

A su vez, observamos en la Figura 18C, un aumento de la fluorescencia en células marcadas con cromogranina A (CrgA). Todos ellos marcadores de diferenciación neuroendocrina (NE). Como control de la eficacia del LY29 inhibiendo PI3K, analizamos la fosforilación de Akt en la Ser473.

En conjunto estos datos preliminares indican, que en la línea de cáncer de próstata sensible a andrógenos LNCaP, el EGF impide la muerte celular provocada por la inhibición de la vía PI3K/Akt, induciendo diferenciación NE.

A partir de estos resultados, nos planteamos estudiar los mecanismos moleculares puestos en juego por el EGF al inhibir PI3K/Akt y que son responsables de la supervivencia y de la adquisición del fenotipo NE en las células LNCaP.

2. 2. 2.

2. CAMCAMCAMCAMBIOS EN LOS RECEPTORBIOS EN LOS RECEPTORBIOS EN LOS RECEPTORBIOS EN LOS RECEPTORES EGFR Y EES EGFR Y EES EGFR Y EES EGFR Y ERRRBB2 EN EL RBB2 EN EL BB2 EN EL BB2 EN EL TRATAMIENTO COMBINAD

TRATAMIENTO COMBINAD TRATAMIENTO COMBINAD

TRATAMIENTO COMBINADO DE EGF Y LY29, EN O DE EGF Y LY29, EN O DE EGF Y LY29, EN LÍNEAS DE O DE EGF Y LY29, EN LÍNEAS DE LÍNEAS DE LÍNEAS DE CÁNCER DE PRÓSTATA

CÁNCER DE PRÓSTATA CÁNCER DE PRÓSTATA CÁNCER DE PRÓSTATA