El ARN total fue extraído del tejido testicular, de otros tejidos elegidos como controles, de los túbulos seminíferos previo a su fraccionamiento celular, y de las distintas poblaciones
celulares aisladas a partir de dichos túbulos. Para ello se empleó el reactivo TRIzol®
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Para favorecer la extracción, los tejidos y las células fueron homogeneizados con el reactivo utilizando un disruptor previamente descontaminado. El material insoluble se removió por
centrifugación a 12000 g a 4ºC por 10 minutos. Luego del tratamiento con TRIzol®, se realizó
una partición de fases mediante el agregado de cloroformo: la fase acuosa clara superior conteniendo el ARN se recuperó, mientras que se descartó la fase orgánica roja inferior (conteniendo ADN y proteínas). El ARN se precipitó de la fase acuosa superior con isopropanol y posteriormente se lavó con etanol 80% (v/v) para remover impurezas. Finalmente, el ARN total aislado se resuspendió en 40 µL de agua libre de ribonucleasas (RNasas) atemperada a 58°C y se determinó su concentración mediante la lectura de la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro PicoDrop. La pureza, determinada mediante
la relación entre las absorbancias a 260 y 280 nm, varió entre 1.75 a 1.95. En todos los
casos se tomaron las precauciones necesarias a fin de evitar contaminaciones con RNasas y las muestras conteniendo ARN se conservaron a -80°C hasta el momento de su utilización para minimizar su degradación.
7.2. Transcripción reversa (RT)
El ARN extraído fue utilizado para sintetizar el ADN complementario (ADNc) de simple hebra empleando la enzima transcriptasa reversa del virus Moloney de la leucemia murina (M-MLV RT, del inglés Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase). A partir de 2 µg de ARN total de cada muestra se realizó la reacción de retrotranscripción en un volumen final de 25 µL completado con agua libre de RNasas y conteniendo 1 µg de
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Random Primers hexamers (Biodynamics), buffer de reacción M-MLV RT 1X (Promega), 0.5
mM de cada uno de los desoxirribonucleótidos (dNTPs, del inglés desoxynucleotide
triphosphates), 25 UI de inhibidor de RNasas (Promega), y 200 UI de la enzima M-MLV RT (Promega), según las indicaciones del fabricante. La reacción fue incubada a 37ºC durante 1 hora y el ADNc obtenido se conservó a -20 °C hasta su uso.
7.3. PCR convencional (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction)
convencional o de punto final se utilizó para detectar la expresión de los transcriptos de los genes codificantes de la familia de las Elovls en los túbulos seminíferos y en las células aisladas a partir de ellos. Esta reacción permite amplificar fragmentos de interés del ADN
utilizando un par de cebadores (en inglés, primers) específicos por acción de una ADN
polimerasa termoestable.
Para las reacciones de PCR, en un volumen final de 20 µL se incubaron 3 µL de la solución de ADNc en presencia de 1 µL de Taq ADN polimerasa (2 UI) (nombrada de esta
forma debido a que es producida por la bacteria termófila Thermus aquaticus), 0.2 mM de
cada uno de los dNTPs, y 0.25 µM de los pares de primers (directo y reverso) en buffer de
reacción 1X. Los pares de primers diseñados para amplificar específicamente los genes
Elovls (Elovl1 a Elovl7) de rata se encuentran listados en la Tabla 1. Las muestras fueron desnaturalizadas a 94°C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de amplificación que consistían en: desnaturalización a 94°C por 30 segundos, apareamiento de los primers a temperaturas específicas para cada par por 30 segundos, y pasos de extensión a 72°C, por 30 segundos y un paso de extensión final por 10 minutos.
Tabla 1. Secuencias (5´- 3´) de los pares de primers utilizados para la amplificación de ADNc mediante RT-PCR convencional.
Las muestras amplificadas fueron mezcladas con el indicador del frente de corrida Blue/Orange 6X (Promega, G1881), en una proporción muestra ADNc: colorante de 5:1, y se sembraron en un gel de agarosa 1.5% preparado con buffer TAE 1X pH 8.3 (de composición
Elovl1 CTCACTGCACATCAGCCAATA GAGTCCTGGTCATGGGTGTAG 57.5
Elovl2 CAGCACACAGGCACCAGG GACTTCAGTGGCTCTCACGG 57.5
Elovl3 CAAAGTGAAGCATCCCAACAT GGTTGTCATAGCTTCCTGCAA 54
Elovl4 GGTTCAGTTCCATGTGACCAT TCTGTTGCCCCTGAACTTTTA 56
Elovl5 ACCACCATGCCACTATGCT GTGTCCATTGACGGCAGT 55
Elovl6 GCTGATCTTCCTGCACTGGTA CGTGATGACCCTGAGCTATGT 57.5
Elovl7 GGGACCAGCCTACCAGAAGTA TCAAGGAAGGCAAGATAGCAG 57.5
β-actina ATGGATGACGATATCGCTG ATGAGGTAGTCTGTCAGG 58
Reverso Temperatura de fusión (°C) Gen Directo
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Tris acetato 40 mM, EDTA 1 mM) conteniendo 2.5% de bromuro de etidio. También se sembraron 10 µL del marcador de peso molecular de ADN de 100 pares de bases CienMarker (Biodynamics, B040-50). Los fragmentos de ADNc amplificados se resolvieron por tamaño, mediante electroforesis del gel en buffer TAE 1X a 100 V durante 30 minutos y se visualizaron bajo transiluminador UV. En aquellas muestras que expresan el transcripto, se observa una banda correspondiente al tamaño del producto amplificado en esas condiciones particulares.
7.4. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
Esta técnica se aplicó para detectar cambios cuantitativos en la expresión de los genes codificantes de Elovl2, Elovl4, Elovl5 y de Fa2h en testículos de rata durante el desarrollo postnatal, en testículos de rata adulta que habían sido previamente sometidos a hipertermia, y en las distintas células aisladas a partir del epitelio seminífero. La qPCR permite cuantificar el producto de la amplificación del ADN al final de cada ciclo. Para ello se utiliza un fluoróforo que se une al ADN de doble hebra y que al ser excitado a la longitud de onda apropiada produce fluorescencia que puede ser medida por un termociclador apto para qPCR.
Los ADNc (2.5 µL) fueron amplificados en un volumen final de reacción de 10 µL
utilizando el KAPA SYBR® FAST qPCR Kit Master Mix Universal (Kapa Biosystems) (5 µL) o
de 12 µL utilizando el SensiFAST SYBR® No-Rox (BioSystems, Argentina) (6 µL) – ambos
kits comerciales compuestos por Taq ADN Polimerasa, dNTPs, Mg2+, conservantes, buffer y
el fluorocromo verde (en este caso SYBR® Green I) - y una concentración de 0.20 µM de
cada primer para el gen de interés. Las secuencias de los primers directo y reverso para la
amplificación específica de los genes Elovl2, Elovl4, Elovl5 y Fa2h de rata se encuentran
listados en la Tabla 2. Fueron diseñados mediante el software Primer3 y adquiridos en
Invitrogen Life Technologies.
Tabla 2. Secuencias (5´- 3´) de los pares de primers utilizados para qRT-PCR.
Elovl2 CGGAATCACACTTCTTTCTGC CACTGCAAGTTGTAGCCTCCT 58
Elovl4 GGTGGATTGGAATCAAGTGG TACCGCTTCCACCAAAGGTA 58
Elovl5 GAGGCATCCTGGTGGTGTAT ACACACCTGTCACCAACTCATAG 58
Fa2h AGTACTATGTGGGCGAACTGC CAATAGCAGCATCTGTCTTCTGA 58
β-actina AAGGCCAACCGTGAAAAGAT ACCAGAGGCATACAGGGACA 58
Agps CCGAGTACCAATGAGTGCAA CCATCCATTCCATTTCATAAGTT 58
Hprt CTCATGGACTGATTATGGACAGGAC GCAGGTCAGCAAAGAACTTATAGCC 58
Pgk1 GCAAAGACTGGCCAAGCTAC GCCTCAGCATATTTCTTACTGCT 58
Tbp TGGGATTGTACCACAGCTCCA CTCATGATGACTGCAGCAAACC 58
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Las condiciones de la qPCR utilizadas fueron las siguientes: 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 20 segundos, apareamiento y extensión a 58ºC por 30 segundos y un paso de extensión final a 72ºC por 30 segundos. El equipo termociclador utilizado fue el Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Australia).
7.5. Validación de la qPCR y análisis de datos
Al final de la fase de amplificación, la especificidad de los productos de reacción, así
como la ausencia de dímeros de primers se confirmaron mediante el análisis de las
correspondientes curvas de melting. Además se realizó electroforesis en gel de agarosa
(1%) a 50 V durante 1 hora para confirmar el tamaño de los amplicones obtenidos (ver Figura 3 de la sección Figuras y Tablas- Capítulo II), siguiendo el procedimiento ya explicado para la PCR convencional.
En todas las corridas de qPCR se realizaron los respectivos controles negativos NTC
(del inglés no template control) reemplazando el ADNc por agua libre de RNasas para
detectar posibles contaminantes y formación de productos indeseados. Además, para asegurar que la amplificación corresponde al ADNc retrotranscripto, se confirmó la ausencia de contaminación con ADN genómino en el ARN extraído de cada muestra mediante qPCR de controles negativos No-RT, en los cuales el ADNc es reemplazado por el respectivo ARN. Valores elevados de Cq (ausencia de expresión) para todos los genes y muestras analizados en los controles No-RT validan las amplificaciones detectadas en presencia del ADNc.
La comparación de los niveles del ARNm de los genes en estudio entre las diferentes muestras y tratamientos se realizó mediante la normalización con respecto a la expresión de genes de referencia validados como controles internos de expresión estable. Para ello, los valores crudos de Cq (del inglés quantification cycle) de los genes de interés (Elovl2, Elov4, Elovl5 y Fa2h) y de los siguientes 5 candidatos a genes de referencia: β-actina, alquilglicerona fosfato sintasa (Agps), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Hprt), proteína de unión a TATA (Tbp), y fosfoglicerato quinasa 1 (Pgk1), fueron importados en el software qBasePLUS (Hellemans et al., 2007). En qBasePLUS, el módulo geNorm permitió identificar la combinación más estable de genes de referencia para cada experimento en
particular (Vandesompele et al., 2002). En el caso del conjunto de datos de muestras de
testículo durante el desarrollo postnatal y luego del tratamiento post-hipertermia, la combinación de 5 genes (Agps, Hprt, Tbp, and Pgk1), lanzó un valor de estabilidad de genes de referencia (parámetro M de geNorm) aceptable, de 0.47 y 0.24 (valores óptimos <0.5) y una variabilidad entre ellos (parámetro V de geNorm) de 0.15 y 0.15 respectivamente (preferentemente <0.15). En el caso de los datos obtenidos para los diferentes tipos
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celulares aislados (SC, EP, ER y ET), el análisis en qBasePLUS indicó que la inclusión de β- actina y de Tbp reduce la estabilidad de los genes de referencia cuando se comparan los
niveles de expresión entre los diferentes tipos celulares en estudio. Por esta razón, β-actina
y Tbp fueron omitidos como genes de referencia, mientras que la combinación de Agps, Hprt
y Pgk1 mostró un valor aceptable del factor M y el valor más bajo de V al comparar los
niveles de expresión entre los tipos celulares. Empleando las combinaciones de genes de referencia validadas y confiables para cada muestra, los niveles de Elovl2, Elovl4, Elovl5 y Fa2h fueron calculados como valores CNRQ (del inglés calibrated normalized relative quantity). Estos valores fueron exportados al software GraphPad Prism para ser analizados estadísticamente.
Para cada una de las muestras o condiciones analizadas se realizaron 3 réplicas biológicas (3 reacciones independientes de retrotranscripción) y 4 réplicas técnicas de cada una de ellas. Finalmente, para asegurar la precisión y confiabilidad de las mediciones, mediante qPCR se realizaron curvas estándar para cada gen usando diluciones seriadas 1/6, 1/60, 1/1600 y 1/6000 de ADNc obtenido de testículo adulto, y las eficiencias de amplificación de los genes de interés y de referencia fueron calculadas mediante la siguiente ecuación:
Eficiencia qPCR = 10-1/pendiente-1
En la Figura 2 de la sección Figuras y Tablas- Capítulo II, se pueden observar las
curvas de eficiencia de todos los pares de primers utilizados, cuyos valores aparecen
expresados en porcentaje.
8. INMUNOFLUORESCENCIA Y MICROSCOPÍA